益康胶囊微生物限度检查方法适用性研究

2022-09-19曹鲁娜任颖慧毕言锋

中国当代医药 2022年23期

关键词：药典适用性培养基

微生物限度检查是保障药品使用安全有效的一项重要参数

，《中华人民共和国药典》（简称《中国药典》）2020年版四部

明确提出对供试品进行微生物限度检查时所选方法应进行适用性试验，从而避免方法缺陷造成的漏检、误判

。中药制剂由于组方药味成分及其相互作用机理复杂，很多制剂有抑菌作用，进行方法适用性试验对保证检测方法的科学性和严谨性尤为重要

。益康胶囊是由人参、黄芪、丹参等十三味药组成的中药复方制剂，具有调节全身代谢，扶正固本等功效，临床上用于治疗冠心病、高脂血症等

。据报道，处方中的黄芪、黄精、丹参等药味均具有一定的抑菌活性

。为保证检验结果真实反映样品中微生物实际污染程度，笔者按照《中国药典》

2020年版四部通则1105，1106，1107 要求，采用3 批样品进行3 次独立试验开展方法适用性研究，以期建立益康胶囊的微生物限度检查方法。

根据研究目的的需要，选择了局部空间自相关的方法，对福州市区域经济差异进一步分析。局部自相关作为空间自相关的一种，是反映每个区域与周边地区之间同一属性值的相似性，用来验证局部区域存在的空间异质性。通常用空间联系的局域指标(LISA)和Moran散点图等进行度量[6]。

1 仪器与材料

1.1 仪器设备

JE1201 电子天平（上海浦春计量仪器有限公司）；MLS-3781L-PC 型高压蒸汽灭菌器（松下健康医疗器械株式会社）；BPH-9272 精密恒温培养箱（上海一恒科学仪器有限公司）；DNP-9162BS-Ⅱ电热恒温培养箱（上海新苗医疗器械制造有限公司）；BSC-1300ⅡA2 生物安全柜（苏州安泰空气技术有限公司）；WGZ-2XJ 型浊度计（上海昕瑞仪器仪表有限公司）。

[20]Indeed,in herculean preparation and glitzy execution,the summit was reminiscent of the Games six years ago,with schools,offices and factories closed to combat the smog,and a similarly spectacular fireworks display over Beijing’s Olympic Park.

1.2 培养基及试剂

胰酪大豆胨琼脂培养基（tryptic soy agar，TSA），胰酪大豆胨液体培养基（trypsin soy broth，TSB），沙氏葡萄糖琼脂培养基（sabouraud dextrose agar，SDA），沙氏葡萄糖液体培养基（sabouraud dextrose broth，SDB），肠道菌增菌液体培养基，麦康凯液体培养基，麦康凯琼脂培养基，紫红胆盐葡萄糖琼脂培养基，RV 沙门菌增菌液体培养基，木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基，均由北京陆桥技术股份有限公司提供。培养基经过适用性检查，符合《中国药典》2020年版四部

规定。0.9%无菌氯化钠溶液（氯化钠，国药集团化学试剂有限公司；按药典要求配制、灭菌）。

湿式诱捕器投放高度20、40、60 cm处理诱捕茶尺蠖成虫总量分别为321、158和148头，平均每台为 80.25、39.50 和 37.00 头，可见高度 20 cm 处理诱捕量最多，并与其他2个处理均达到显著差异，高度40和60 cm处理诱捕效果相当，因此，湿式诱捕器在茶园的最优投放高度为20 cm。

1.3 菌种

供试品对照组：取“2.1”项下1∶10 供试液9.9 ml，加入TSB 0.1 ml，混匀，取其1 ml 注入直径90 mm 的无菌平皿，平行制备2 个平皿。

1.4 供试品

按照《中国药典》2020 版四部

对菌种的培养要求进行菌液制备。将金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌和黑曲霉制备成每1 毫升含菌落数为5000～10 000 cfu 的菌悬液，用于微生物计数；将铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、乙型副伤寒沙门菌制备成每1 毫升不大于100 cfu 的菌悬液，用于控制菌检查。

2.5.1 阳性对照组大肠埃希菌检查取“2.1”项下1∶10供试液10 ml；耐胆盐革兰阴性菌取1 ml，0.1 ml，0.01 ml 的预培养物（“2.1”项下1∶10 供试液23℃培养2 h），沙门菌取“1.4”项下供试品10 g；上述供试液分别加入“2.2”项下用于控制菌检查的对应菌液，接种至对应的规定培养基，混匀，33℃培养24 h。

2 方法与结果

2.1 供试液制备

取“1.4” 项下供试品10 g，加入TSB 至100 ml，45℃水浴保温振荡15 min，制成1∶10 的供试液；取1∶10的供试液适量，加入TSB 依法制成1∶20、1∶50 供试液

。

2.2 试验菌液制备

益康胶囊，陕西君碧莎制药有限公司，规格：每粒装0.4 g（含维生素E 33.3 mg），批号：20201121，20210612，20210918。

2.3 计算与结果判断

按照《中国药典》2020年版四部

规定。

2.4 计数方法适用性试验

2.4.3 需氧菌总数[平皿倾注法（1∶20）]试验组、供试品对照组和菌液对照组的制备：除将“2.4.1”项下1∶10 供试液更换为1∶20 供试液外，其他操作步骤同“2.4.1”项下，试验结果详见表2。由表2 可见，采用平皿倾注法（1∶20）进行需氧菌总数方法适用性试验时，各试验菌株回收比值均在0.5～2 范围内，表明该方法可行。

铜绿假单胞菌、白色念珠菌、黑曲霉、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、乙型副伤寒沙门菌、大肠埃希菌，以上菌种英文名称及编号均与《中国药典》2020年版四部

要求相符。均来源于广东环凯微生物科技有限公司，经复苏传代并鉴定合格，本次试验所用菌种均为第4 代。

菌液对照组：取TSB 9.9 ml，按试验组操作加入5种试验菌液各0.1 ml（菌落数为5000～10 000 cfu/ml），进行菌种回收试验。

试验结果：稀释浓度为1∶20 时，枯草芽孢杆菌的回收比值分别为0.91、0.78、0.82；稀释浓度为1∶50时，其回收比值分别为0.90、0.84、0.79。由以上数据可知，两个稀释浓度回收比值较为接近，当两个稀释浓度回收比值均符合要求时，宜选取较低稀释浓度，因此需氧菌总数计数可采用平皿倾注法（1∶20）。

以上各组平皿，按照《中国药典》2020年版四部

要求注入15～20 ml 相对应的SDA 或TSA，测定各平皿菌落数，计算各试验菌回收比值，结果详见表1。由表1 可知，需氧菌总数采用平皿倾注法（1∶10），枯草芽孢杆菌回收比值小于0.5，霉菌和酵母菌总数各试验菌回收比值均在0.5～2 范围内。表明益康胶囊对枯草芽孢杆菌有抑菌活性，其霉菌和酵母菌总数可采用平皿倾注法（1∶10）。

2.4.2 需氧菌总数（预试验）以枯草芽孢杆菌作为敏感菌株，采用平皿倾注法（1∶20，1∶50）对需氧菌总数重新开展试验。取“2.1”项下1∶20，1∶50 供试液各9.9 ml，试验菌液取“2.2”项下枯草芽孢杆菌菌悬液0.1 ml，使每1 ml 供试液含菌量不大于100 cfu，其余照“2.4.1”项进行试验。

学者钱钟书也是个善于“偷”时间的人。他从来不参加应酬，不论再高规格、再有面子的饭局，也照拒不误，因为在他眼里，在饭桌上浪费时间，挥霍生命，是世上最愚蠢的事情。他把这些时间都偷来著书立说，钻研学问，成了大学者。

2.4.1 需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数[平皿倾注法（1∶10）]试验组：取“2.1”项下1∶10 供试液分装于无菌试管中，每管9.9 ml，分别加入“2.2”项下用于微生物计数的5 种试验菌液0.1 ml，混匀，取上述混合液各1 ml 注入直径90 mm 的无菌平皿中，每种试验菌平行制备2 个平皿。

2.5 控制菌检查方法适用性试验

按照《中国药典》2020年版四部

要求，益康胶囊控制菌检查应为大肠埃希菌、耐胆盐革兰阴性菌和沙门菌3 种。

冬季参加体育锻炼，户外活动最好选在广场、树林、草地、空气清新洁净的地方，便于机体在锻炼时吸入更多新鲜空气；避免在车辆、行人较多的道路旁和大雾天锻炼，减少尾气和烟尘对呼吸系统的影响；同时要注意选择相对松软的场地，避免场地坚硬对脚、腿、关节、骨骼的伤害。在室内进行锻炼时，一定要保持室内空气的流通。因为，人在安静状态下每小时呼出的二氧化碳有20多升。若十多个人同时进行锻炼，一小时就是200升以上，再加上汗水的分解产物，消化道排除的不良气体等，会致使室内空气受到严重污染。人在这样的环境中会出现头昏、疲劳、恶心、食欲不振等现象，锻炼效果自然不佳。

2.5.2 供试品组大肠埃希菌、耐胆盐革兰阴性菌、沙门菌供试液同“2.5.1”项下，均不加试验菌液，其他同相对应的阳性对照组操作步骤分别制备供试品组。

2.5.3 阴性对照组上述3 种控制菌检查，均取稀释剂代替供试液，其他同相对应的供试品组，制备阴性对照组。

2.5.4 试验结果按照《中国药典》2020年版四部

规定进一步选择和分离培养，如果阳性对照组生长良好，表明益康胶囊对该菌无抑菌活性，方法成立；如果无菌落生长，表明样品对该菌有抑菌活性，则需采用增加培养基体积等适宜的方法去除其抑菌活性后重复上述试验，结果见表3。由表3 可见，阳性对照组均生长良好，供试品组和阴性对照组均无菌落生长，表明益康胶囊可以采用常规培养基体积进行控制菌检查。

本文分析由制造商主导的Stackelberg博弈的均衡解，制造商主导的Stackelberg博弈的分散决策顺序如下：

3 讨论

3.1 建立方法适用性试验遵循的原则

方法适用性试验的本质是建立对样品影响更小、操作效率更高的方法

，去除样品抑菌性是其中的重点和难点

，设计试验方案时应遵循由简到繁，由单一到联合的原则，采取循序渐进的方式逐步开展。本研究采用平皿倾注法（1∶10）进行微生物计数时，霉菌和酵母菌总数各试验菌株回收比值均在0.5～2 范围内；需氧菌总数计数中枯草芽孢杆菌回收比值小于0.5，遂采用增加稀释倍数重新进行试验，采用平皿倾注法（1∶20）时，需氧菌总数计数5 种试验菌株回收比值均在0.5～2 范围内；进行控制菌检查时，采用常规培养基体积对益康胶囊进行方法适用性试验，结果阳性对照组均生长良好，阴性对照组均无菌落生长，表明该方法可靠有效。