静置培养条件下混合菌群对活性黑5脱色效果分析

汪 波，刘 娜，秦祎婷，朱少东，郭庆贤，张 悦，董传斌，张海洋

(1 宿州学院环境与测绘工程学院，安徽 宿州 234000；2 宿州学院沱河流域面源污染控制与生态修复技术研究中心，安徽 宿州 234000)

随着科技水平发展与社会进步，人们对服装染色技术的要求日益提高，偶氮染料在纺织工业中有着广泛的应用。然而，伴随产生的工业染料废水污染性极强，导致水体环境的污染和恶化，危害人体的健康[1-3]。偶氮染料脱色降解方法主要有物理法、化学法、生物法等[4-5]，其中，利用生物处理技术，既能降低染料废水处理费用，又能减少化学药剂的使用，从而可以降低一定程度上的环境污染。谢学辉等[6]利用主要由克雷伯氏菌(Klebsiella)和变形菌(Proteus)组成的混合菌群FF，对偶氮染料活性黑5(200 mg/L)进行脱色降解，结果表明，混合菌群对活性黑5的脱色率在反应24 h后可达到91.4%。李雨等[7]筛选出一株肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)，对多种偶氮染料(刚果红、甲基橙、甲基红等)具有较好的脱色效果。本研究在静置培养条件下，从宿州市埇桥区生活污水处理厂污泥中驯化混合菌群，并在不同pH值、初始染料浓度、碳源条件下，分析混合菌群对活性黑5的脱色效果差异性，为偶氮染料活性黑5的生物脱色提供新的菌群。

1 实验材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 染料和培养基

本实验所选偶氮染料是相对分子质量991.82的活性黑5，其分子式为C26H21N5Na4O19S6，特征峰波长是597 nm。

培养基组成(g/L)：磷酸二氢钾2.66、氯化铵0.20、无水硫酸钠0.50、牛肉膏1.50、蛋白胨1.50，活性黑5(按需要定量)。

活性黑5、磷酸二氢钾、氯化铵、无水硫酸钠、牛肉膏、蛋白胨、果糖、淀粉、麦芽糖、蔗糖、木糖均为分析纯以上级别。

1.1.2 实验设备与仪器

高压蒸汽灭菌锅、紫外可见分光光度计、电子天平、pH计、超净工作台、生化培养箱、干燥箱等。

1.2 实验方法

1.2.1 混合菌群的驯化

对宿州市埇桥区生活污水处理厂污泥进行采样，并将其用作初始接种污泥，以偶氮染料活性黑5为脱色目标物。首先，将10 mL的活性污泥接入一个装有90 mL染料溶液的锥形瓶中，控制染料初始浓度为10 mg/L。然后每隔48 h以10%的体积百分比将细菌重新接入到新鲜的培养基中，当脱色率达到80%时，适当增加染料的浓度，进行下一阶段的驯化。通过2个月左右的驯化和筛选，获得了活性黑5的脱色混合菌群。利用光学显微镜对混合菌群进行镜检，分析其形态特征。

1.2.2 不同pH值对脱色效果的影响

分别调节染料培养基的pH为5、6、7、8、9，以10%(V/V)的接种量，分别取10 mL培养了48 h的混合菌群，加入含有90 mL新鲜培养基的锥形瓶中，加入活性黑5使其最终浓度为100 mg/L。静置培养72 h，每隔24 h取脱色菌液，并以10000 r/min离心，再取上清液。采用紫外-可见分光光度计测定特征波长597 nm的吸光度值，并按下式计算脱色率。

脱色率=(A0-At)/A0×100%

式中：A0——反应0 h脱色液在597 nm的吸光度值

At——反应t h脱色液在597 nm的吸光度值

1.2.3 不同初始染料浓度对脱色效果的影响

在上述最佳pH值条件下，控制培养基中染料的最终浓度分别为50 mg/L、80 mg/L、100 mg/L、150 mg/L，探讨不同初始染料浓度对混合菌群脱色活性黑5效果的差异性，具体实验步骤同1.2.2。

1.2.4 不同碳源对脱色效果的影响

分别采用不同的碳源替换原有培养基中的牛肉膏，使培养基的碳氮源分别为果糖+蛋白胨、淀粉+蛋白胨、麦芽糖+蛋白胨、蔗糖+蛋白胨、木糖+蛋白胨，探讨不同碳源对混合菌群脱色活性黑5的效果差异性，具体实验步骤同1.2.2。

2 结果与讨论

2.1 混合菌群形态特征分析

利用光学显微镜对驯化得到的混合菌群进行镜检，结果如图1所示。显微镜下的细菌大小不一、形态各异，以杆菌为主，这些形态不同的细菌组成细菌群落，通过彼此之间的相互协作，往往能够获得较好的脱色效果[8]。惠丰立等[9]利用由Clostridium、Pseudomonas和Shewanella组成的混合菌群AR1，对活性红BF-3BN(200 mg/L)进行脱色研究，结果表明该菌群在最佳环境条件下可获得95%以上的脱色率，脱色效果显著。

图1 显微镜下混合菌群形态Fig.1 Morphology of mixed flora under microscope

2.2 pH值对脱色效果的影响

染料废水微生物处理过程中，环境pH值会对微生物的生长造成一定的影响，从而影响细菌对染料的去除[10]。结果表明，不同pH对混合菌群脱色率的影响见图2所示。可以看出，当pH为5时，菌群对活性黑5的脱色率在72 h为73.48%；当pH为6、7、8时，脱色率在72 h分别为74.09%、76.64%、和79.72%；随着pH进一步升高到9，菌群对活性黑5的脱色率可达到81.89%。结果表明，菌群不同pH环境下，菌群的生长代谢受到不同影响，与偏酸性、中性条件相比，在偏碱性条件下，混合菌群获得更高的脱色率，说明菌群的耐碱性较强，偏碱性环境也更适宜微生物生长代谢。与本研究结果类似，周思懿等[11]也在研究中指出，菌群在偏碱性条件下获得了更高的脱色率。由于一般实际染料废水的pH偏高，因此，本研究获得的混合菌群对于处理实际染料废水具有现实指导意义。

图2 不同pH值条件下混合菌群对活性黑5的脱色率Fig.2 Decolorization rate of Reactive Black 5 by mixed flora under different pH valueconditions

2.3 不同初始染料浓度对脱色效果的影响

在上述最佳pH条件下，研究不同初始染料浓度对脱色活性黑5的影响，结果见图3所示。从图3中可以看出，在初始染料浓度为50～150 mg/L时，混合菌群对活性黑5的脱色率在72 h均可达到80%左右，呈现出较好的脱色效果。当初始染料浓度为50 mg/L时，混合菌群对活性黑5的脱色率在72 h时为82.78%，随着初始染料浓度不断增高，混合菌群对偶氮染料的脱色率逐渐降低。这是因为随着染料浓度的增加，其毒性也随之增大，微生物的正常生长和代谢活动会在一定程度上受到抑制，从而导致脱色效果变差[12]。

图3 不同初始染料浓度条件下混合菌群对活性黑5的脱色率Fig.3 Decolorization rate of Reactive Black 5 by mixed flora under different initial dye concentration conditions

2.4 不同碳源对脱色效果的影响

混合菌群脱色染料的效果与微生物的生长密不可分，而微生物的生长和繁殖离不开碳源，因此，外来碳源的添加能够促进细菌脱色效果[13-14]。本研究中，在pH为9条件下，分别采用不同碳源替换原培养基中的牛肉膏，不同碳源对菌群脱色效果的影响见图4所示。由图4可以看出，当果糖、淀粉、蔗糖、麦芽糖、木糖分别与蛋白胨组合后，混合菌群对活性黑5的脱色率在72 h均达到90%左右，呈现出较为显著的脱色效果，且均优于牛肉膏、蛋白胨组合(图3)。其中，除淀粉外，其他碳源存在下，反应24 h的脱色率均达到85%以上，说明混合菌群对活性黑5脱色速率较快。Ceretta等[15]也在研究中指出，葡萄糖、淀粉的添加能够提高混合菌群对染料废水的脱色效果。

图4 不同碳源条件下混合菌群对活性黑5的脱色率Fig.4 Decolorization rate of Reactive Black 5by mixed flora under different carbon source conditions

3 结 论

本研究以宿州市埇桥区生活污水处理厂污泥作为原始接种污泥，驯化获得能够脱色偶氮染料活性黑5的混合菌群，并研究不同pH值、初始染料浓度、碳源等因素对混合菌群脱色效果的影响。研究结果表明，随着pH的升高，混合菌群脱色活性黑5效果逐渐增强，说明偏碱性条件更有利于混合菌群的生长繁殖和脱色作用。当初始染料浓度升高(50～150 mg/L)时，混合菌群的脱色作用逐渐减弱，说明高浓度染料对混合菌群的生长和繁殖具有一定抑制作用。当pH为9时，不同碳源与蛋白胨组合后，均取得了较为显著的脱色效果。本研究为后续进一步研究混合菌群群落结构及其实际应用奠定基础。