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新型齐墩果酸-1,2,3-三氮唑衍生物的设计、合成及活性研究*

2022-09-17杨东鑫王友德张丽颖

广州化工 2022年16期
关键词:齐墩氧基衍生物

杨东鑫,王友德,张丽颖

(河北省中药研究与开发重点实验室,承德医学院中药研究所,河北 承德 067000)

齐墩果酸(oleanolic acid, OA, 图1),又名庆四素或土当归酸,属齐墩果烷型五环三萜结构的化合物。女贞子为木樨科常绿乔木女贞(ligustrum lucidum ait)的干燥成熟果实。OA为女贞子植物中分离得到的有效成份,以游离体或糖苷的形式广泛存在于在自然界中。随着研究不断进展,OA多样的药理作用已被揭晓,如抗肿瘤[1-3]、抗高血糖[4-5]、抗炎[6-7]、抗HIV[8]和抗氧化[9-10]等。OA的降糖作用也受到了广泛关注:Ortiz-Andrade等通过口服葡萄糖耐量实验发现,OA可以抑制血浆葡萄糖浓度的增高[11]。然而,OA衍生物相关的降糖作用还未得到系统性研究。

图1 OA衍生物的合成路线Fig.1 Synthetic route of OA derivatives

三唑类化合物因其具有显著的广谱生物活性,已成为研究的热点药效团[12-13]。其中,1,2,3-三氮唑结构因其在结合亲和力方面表现十分显著,且具有优良的代谢稳定性,在药物开发中被广泛应用[14]。因此,本文推测OA-1,2,3-三氮唑衍生物可能同样具备降糖作用。实验中以OA为先导化合物,应用click化学技术[15]和活性基团拼接原理,在OA的C-3位引入含不同取代基的1,2,3-三氮唑结构。本实验对OA的C-3位进行结构改造,合成了两种新型OA-1,2,3-三氮唑衍生物,并对其进行了HepG2细胞葡萄糖消耗实验,以期为女贞子降血糖方面的研究奠定基础。

1 仪器与试剂

RY-1熔点仪,天津市分析仪器厂;电热鼓风干燥箱,上海福玛实验设备有限公司;AVANCE-300 MHz型核磁共振仪,德国 布鲁克公司;数显示水浴锅,国华电器有限公司;752分光光度计;maXis impact-HRMS,德国 布鲁克公司;SHIMADZU FTIR-8400S傅里叶变换红外光谱仪,德国布鲁克公司。

葡萄糖测定试剂盒,上海荣升生物技术有限公司;FBS胎牛血清,鼎国生物技术有限公司;碳酸氢钠,南京化学试剂有限公司;RMPI Medium 1640 GIBCO invitrogen corporation;二甲亚砜,上海凌峰化学试剂有限公司。所用试剂均为化学纯或分析纯试剂。人肝癌细胞HepG2,由承德医学院附属医院检验科赠予。

2 方法与结果

2.1 化合物的合成与表征

2.1.1 4-(2-丙炔氧基)苯甲醛(3)

将溴丙炔(0.42 g,3.48 mmol)滴加在对羟基苯甲醛(0.4 g,3.27 mmol)和碳酸钾(0.87 g,6.32 mmol)的无水DMF(10 mL)混合溶液中,于25 ℃下搅拌12 h。将滤除K2CO3的滤液倒入水中,乙酸乙酯萃取三次,有机相以1 N HCl(aq)、饱和NaHCO3溶液和NaCl水溶液依次洗涤,干燥后减压蒸馏,得4-(2-丙炔氧基)苯甲醛。无须纯化直接用于下一步反应。

2.1.2 3β-[4-醛基苯氧基甲基-(1-氢-1,2,3-三氮唑-1-基)]乙酰氧基齐墩果烷-12-烯-28-羧酸苄酯(7)

将3β-叠氮乙酰氧基齐墩果烷-12-烯-28-羧酸苄酯(6)[16](0.2 g, 0.32 mmol)和4-(2-丙炔氧基)苯甲醛(56 mg, 0.32 mmol) 溶于CH2Cl2/H2O(1/1, 6 mL)的混合溶剂中,搅拌下依次加入CuSO4·5H2O(28 mg, 0.11 mmol)和抗坏血酸钠(45 mg, 0.23 mmol)。25 ℃下反应12 h后,减压蒸馏,粗品以乙酸乙酯稀释,水洗后无水Na2SO4干燥,减压蒸馏,快速柱层析(乙酸乙酯/石油醚=1/5, V/V)纯化,得白色固体产物(0.24 g, 94%)。m.p.90~92 ℃;IR(KBr, cm-1): 2947, 1744, 1727, 1694;1H-NMR(300 MHz): 0.60, 0.72, 0.82, 0.88, 0.89, 0.92, 1.11(each 3H, s), 2.90(1H, dd,J=4.6, 14.5 Hz), 4.55~4.60(1H, m), 5.03(1H, d,J=12.5 Hz), 5.09(1H, d,J=12.5 Hz), 5.17(2H, s), 5.27(1H, t), 5.33(2H, s), 7.11(2H, d,J=6.8 Hz), 7.29~7.36(5H, m), 7.78(1H, s), 7.84(2H, d,J=6.8 Hz), 9.89(2H, s);13C-NMR(75 MHz): 190.6, 177.3, 165.7, 163.1, 143.7, 136.4, 131.9, 128.4, 128.0, 127.9, 124.2, 122.2, 115.1, 84.0, 65.9, 62.1, 55.2, 51.2, 47.5, 46.7, 45.8, 41.7, 41.4, 39.3, 38.0, 37.7, 36.8, 33.8, 33.0, 32.6, 32.3, 30.6, 28.0, 27.6, 25.8, 23.6, 23.4, 23.3, 23.0, 18.1, 16.8, 16.5, 15.3;ESI-MS: 812.4[M+H]+。

2.1.3 3β-[4-甲基苯氧基甲基-(1-氢-1,2,3-三氮唑-1-基)]乙酰氧基齐墩果烷-12-烯-28-羧酸(8)

将上述所得化合物7(81 mg, 0.10 mmol) 溶于四氢呋喃(10 mL),加入催化量的10%Pd-C。25 ℃下常压氢化24 h。滤除Pd-C后,减压蒸馏得粘稠液体。快速柱层析(乙酸乙酯/石油醚=1/4, V/V)纯化,得白色固体(36 mg, 51%)。m.p.163~165 ℃;IR(KBr, cm-1): 3349, 2944, 1745, 1692, 1509;1H-NMR(300 MHz): 0.73, 0.74, 0.83, 0.90, 0.91, 0.92, 1.12(each 3H, s), 2.81(1H, d,J=9.8 Hz), 4.55~4.60(1H, m), 5.14(2H, s), 5.22(2H, s), 5.27(1H, t), 6.87(2H, d,J=8.6 Hz), 7.07(2H, d,J=8.6 Hz), 7.73(1H, s);13C-NMR(75 MHz): 183.1, 165.8, 156.1, 142.6, 130.5, 129.9, 123.9, 122.4, 114.6, 83.8, 62.1, 55.2, 51.2, 47.5, 46.5, 45.8, 41.6, 41.0, 39.3, 37.9, 37.7, 36.9, 33.8, 33.0, 32.5, 32.4, 30.6, 28.0, 27.6, 25.8, 23.5, 23.3, 22.9, 20.4, 18.1, 17.0, 16.4, 15.3;ESI-MS: 684.4[M-H]-。

2.2 HepG2细胞葡萄糖消耗作用检测

2.2.1 实验方法

参照文献方法[17], 以胰岛素为阳性对照,对目标化合物7和8进行HepG2细胞葡萄糖消耗作用测定实验。将HepG2细胞以1×105/孔接种于96孔板,用含10%胎牛血清的1640高糖培养液培养,待细胞生长至60%融合时,弃培养液。将细胞分为对照组(空白组与胰岛素组)和待测化合物组(化合物7组与化合物8组),其中胰岛素浓度为1×10-7mmol/L,待测化合物组浓度为100 μmol/L。同一水平6孔并列,于培养24 h后采用葡萄糖氧化酶法测定培养液中葡萄糖吸光度以及浓度的变化。通过双尾学生t-分布检验,分别计算空白组与胰岛素组、空白组与化合物7组、空白组与化合物8组的葡萄糖吸光度差异,P值<0.05被认为具有统计显著性。

2.2.2 实验结果

两种OA衍生物对HepG2细胞葡萄糖消耗作用的影响结果如表1所示,数据表明,胰岛素组表现符合预期,与空白组相比,胰岛素组能够显著促进HepG2细胞对葡萄糖的消耗(P=0.036),证明本实验的可靠性。在高糖环境下,化合物7组和化合物8组在体外预作用24 h后,与空白组相比, 对HepG2细胞的葡萄糖消耗量均起到了促进作用,并增加了细胞对葡萄糖的摄取。值得一提的是,化合物7组能够显著促进HepG2细胞对葡萄糖的消耗(P=0.038),值得进一步研究。

表1 目标化合物对HepG2细胞葡萄糖消耗的影响Table 1 Effects of target compounds on glucose consumption of HepG2 cells

a葡萄糖吸光度=平均值±标准差;b以胰岛素为阳性对照;cn=6。

3 结 论

祖国医学对女贞子的应用已有上千年的历史,经现代科学研究证实,OA是其主要的活性成分,在体内外实验中均表现出较好的降血糖活性[18-19]。随着当今社会人均生活水平的不断提高,糖尿病已然成为了严峻的全球公共卫生问题。据预测,到2045年,全球受到糖尿病的威胁的人数将会增加到6.93亿人[20]。因此,开发新型有效抗高血糖药物以满足不同的临床用药需求显得尤为重要。

本文以OA为先导化合物,通过click化学技术在OA的C-3位引入1,2,3-三氮唑结构,设计并合成得到两种未见文献报道的新型OA-1,2,3-三氮唑衍生物并对其结构进行了确证。此外,本文对上述衍生物进行了HepG2细胞葡萄糖消耗测试。结果表明:OA-1,2,3-三氮唑衍生物具有潜在的降糖作用,为OA-1,2,3-三氮唑衍生物在降糖药物的研究方面提供了参考数据。

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