HPLC法测定不同产区枸杞子中4种活性成分含量*

尹美娟，王 靓

(河北中医学院，河北 石家庄 050091)

枸杞子为茄科植物宁夏枸杞LyciumbarbarumL.的干燥成熟果实，始载于《神农本草经》。《本草纲目》上记载：“枸杞能补肝肾、润肺、生精、益气。此乃平补之药”。现代药理学研究表明，枸杞具有促进和调节抗衰老、免疫功能和保肝三大药理作用[1]。枸杞作为一味药食两用的药材，在人们的生活中扮演了一个重要的角色[2]，产地较为丰富，市场上流通多为道地产区宁夏的枸杞子，除宁夏外也被广泛种植于青海、甘肃、河北等中国北方省份。目前，如何简单、快速的判断不同性产区枸杞的药用价值，是药学研究工作者的一项重要的课题。

枸杞中主要含有多糖、黄酮、酚酸和生物碱等类化学成分。其中酚酸类成分具有清除自由基抗氧化、增强免疫力、抗菌消炎、抗肿瘤等药理作用[3-4]。因此,酚酸类成分是枸杞生物活性的重要物质基础。枸杞具有这些药理活性可能与其中的某些酚类成分存在一定关系。绿原酸是枸杞中主要酚酸类成分之一，研究表明绿原酸类具有提高免疫力、抗癌、抗菌等生理活性[5-7]。枸杞中以多糖和黄酮类化合物含量较高[8]，黄酮提取物对超氧阴离子、·OH、DPPH、亚硝基以及ABTS自由基具有显著的清除能力[9],芦丁是枸杞中主要的黄酮苷类化合物之一，也属于多酚类物质，具有明显的抗氧化作用。研究发现，黑果枸杞叶中的黄酮类化合物具有显著的抗衰老、降低血脂作用，可能与所含的芦丁等黄酮类成分的含量有关[10]。咖啡酸属于本丙酸类化合物，具有抗菌抗病毒、凝血、降血脂、中枢兴奋等作用[11]。东莨菪内酯鼠香豆素类化合物，是枸杞中重要的生物活性成分之一[12]，具有抗炎、抗肿瘤、调节心血管等作用[13-14]。并且，东莨菪内酯等香豆素类成分在植物适应环境中具有非常重要的生态功能[15]。

本文通过对市面上常见的宁夏、青海、甘肃、河北4个产地枸杞子，建立HPLC高效液相色谱法同时对绿原酸、芦丁、咖啡酸、东莨菪内酯4种有效成分含量进行测定分析，为后续的科学研究进行铺垫。

1 仪器与材料

1.1 试验设备器材

岛津高效液相色谱仪(配置泵LC-20A型，DGU-20A5R真空脱气机，LC-20AT溶液传输单元，CTO-20A柱温箱，SPD-M20A二级管阵列检测器和色谱工作站)，日本岛津公司；Bp211-D型电子天平(十万分之一)，德国Sartorous公司；KQ-250DE型数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；CHA-S恒温振荡器，常州国华电器有限公司；DHG-9145AZ型电热干燥箱，上海恒科仪器有限公司；5810R型高速离心机，德国Eppendorf公司。

1.2 试验材料

宁夏枸杞和甘肃枸杞样品,安国市华仁药材有限公司;青海枸杞和河北巨鹿枸杞样品,安国市永泰中药材有限公司;芦丁,山东丰泰生物科技有限公司;绿原酸,三原天域生物制品有限公司;咖啡酸和东莨菪内酯,中国食品药品检定研究院;分析纯甲醇,北京天地首和科技发展有限公司;乙腈,南昌市恒利化工有限公司;冰醋酸,上海晖创化学仪器有限公司;超纯水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱为DiamonsiL C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)柱，流动相A为乙腈-水-醋酸(5:94.5:0.5)，流动相B为乙腈-水-醋酸(72:27.5:0.5)，梯度洗脱(0～20 min，100%～90%A；20～35 min，90%～75%A；35～45 min，75%～50%A；45～55 min，50%～30%A；55～65 min，30%～0%A；65～70 min，0%～100%；70～75 min，100%～100%A)；流速1 mL/min，进样量10 μL，柱温30 ℃，检测波长为346 nm，对照品及样品色谱图见图1所示。

图1 混合对照品(A)与甘肃枸杞样品(B)HPLC色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of mixed reference substance (A) and Gansu Fructus lycii sample (B)

2.2 对照品溶液的制备

分别精密称取绿原酸1.52 mg，咖啡酸0.68 mg，东莨菪内酯1.28 mg，置于10 mL量瓶中，加50%甲醇溶解，稀释至刻度，摇匀，制成相应的贮备液。精密称取芦丁4.41 mg，置于25 mL量瓶中，加50%甲醇溶解，稀释至刻度，摇匀，制成相应的贮备液。然后，精密吸取各贮备液1 mL，置于10 mL量瓶中，既得混合对照品溶液(每1 mL溶液中分别含有绿原酸0.0152 mg，咖啡酸0.0068 mg，东莨菪内酯0.0128 mg，芦丁0.0176 mg)。

2.3 供试品溶液的制备

精密称取干燥的宁夏枸杞、青海枸杞、甘肃枸杞和河北枸杞10.000 g，用50%甲醇超声提取15 min，料液比为(1:20)。提取完成后，提取液过滤，并用少量的甲醇多次洗涤滤渣，合并滤液浓缩提取液，并定容于10 mL量瓶中备用。使用时，从10 mL的量瓶中精密吸取浓缩的提取液1 mL于10 mL的量瓶中，并用50%的甲醇定容，用0.45 μm的有机滤膜过滤，即得供试品溶液。

2.4 线性关系考察

分别吸取“2.2”项下的混合对照品溶液，依照“2.1”项下的方法分别取5、10、15、20、25、30、40、45 μL注入色谱仪，以进样量(μL)为自变量(X)，色谱峰面积为因变量(Y)，绘制标准曲线，建立回归方程。线性考察结果见表1所示。

表1 各化学成分线性关系Table 1 Linear relationship of chemical components

2.5 精密度试验

精密吸取混合对照品溶液10 μL，依照“2.1”项下的方法进行实验，连续重复进样测定5次，计算峰面积RSD。结果绿原酸、咖啡酸、东莨菪内酯、芦丁的RSD分别为0.2463%、0.2268%、1.7916%、0.1582%，表明仪器精密度良好。

2.6 重现性试验

精密称取同一枸杞样品(宁夏)，按“2.3”项下的方法平行制备6份供试品溶液，并按“2.1”项下色谱条件进行测定。计算绿原酸、东莨菪内酯、咖啡酸和芦丁的平均含量分别为0.0812 mg/g，0.1073 mg/g、0.0857 mg/g、0.2249 mg/g，RSD 分别为1.9%、1.2%、1.1%、1.9%。

2.7 稳定性试验

精密吸取“2.3”项下的供试品溶液10 μL，依照“2.1”项下的方法，分别于0、2、4、8、12 h进样，计算峰面积RSD。结果绿原酸、咖啡酸、东莨菪内酯、芦丁的RSD分别为1.84%、0.49%、0.39%、1.07%，表明样品在稳定性良好。

2.8 加样回收率试验

精密量取已测定含量的供试品(产地宁夏)9份，每份5 mL。然后，3份加入“2.2”项下的混合对照品溶液2 mL，3份加入混合对照品溶液3 mL，3份加入混合对照品溶液4 mL，在“2.1“项色谱条件下测定，计算加样回收率RSD。结果见表2所示。

表2 加样回收率结果Table 2 Add sample recovery results

2.9 含量测定

精密吸取“2.3”项下的各供试品溶液10 μL，依照“2.1”项下的方法进行实验，计算峰面积，进而计算各产地供试品中6种成分的含量，结果见表3所示。

表3 不同产地枸杞子的含量测定结果(n=3)Table 3 Content determination of Fructus lycii from different origin(n=3) (mg/g)

3 结 论

枸杞既具有药用价值又是养生滋补佳品，已有越多的人所喜爱，所以枸杞药材质量备受关注。枸杞次生代谢产物种类较多，快速测定多种成分具有一定的难度，文献研究发现，枸杞药材质量的研究主要集中在多糖类、黄酮类、生物碱类、香豆素类等物质的含量测定[15-20]，想要一次性测定多种成分具有一定难度。为了能够更简单、快速、准确的反映枸杞的药材质量，本研究选择了4种枸杞中常见的不同类别的具有酚酸性的代表活性成分，建立了高效液相色谱含量测定方法，该方法简单便捷，回收率高，精密度、线性、稳定性均符合要求，可作为枸杞药材质量标准含量测定的方法。

由实验测定结果分析可知:不同产地样品中4种成分的含量大体上依次为宁夏样品>青海样品>甘肃样品>河北样品。宁夏枸杞作为道地药材，4种活性成分含量均比较高，本方法也反映出宁夏枸杞的药材质量最好，与其他文献测定结果相符合，该方法具有准确性。所有样品中4种成分的平均含量大体上依次为芦丁>东莨菪内酯>咖啡酸>绿原酸。样品中芦丁和东莨菪内酯的含量较高，并且已经证实，芦丁和东莨菪内酯都是枸杞子含有的具有体外抗氧化活性的重要化合物[21]，东莨菪内酯还在生长环境适应中具有重要作用，枸杞中东莨菪内酯含量较高，可能是其能适应生长环境较广泛的原因。从以上结果可以看出，该方法能够较为简单的分辨枸杞药材质量，但如果想要全面的评价宁夏枸杞的品质好坏，只是测定某些活性成分含量的差异是不全面的,还有需要通过指纹图谱和药效作用方面的研究,才能更充分的对枸杞的品质进行客观、科学地评价。