核糖体工程技术选育优质菌株的研究进展

陈骁昱,吴 忧,雷佳乐,李佳柯,孙文艳,章华伟

(浙江工业大学 药学院,浙江 杭州 310014)

微生物次级代谢产物结构丰富且生物活性多样,在医药领域应用广泛,是天然药物先导物的重要来源[1-2],然而野生菌株来源的先导物含量低、组分杂,严重影响其产业化应用。核糖体工程是一种通过靶向核糖体的抗生素引入耐药性突变来调节核糖体成分(核糖体蛋白或rRNA),从而增加微生物次级代谢产物产量的技术,主要以核糖体和RNA聚合酶为靶目标进行修饰和改造,通过产生抗生素抗性突变诱导微生物核糖体结构的改变,从而引起胞内基因表达以及蛋白合成能力的改变,进而影响其次级代谢产物的生物合成能力。该技术已被广泛应用于高产优质菌株的选育,如放线菌[3]、杆菌[4-5]和真菌[6]等,不仅能有效提高目标先导物的生产效价,而且能高效挖掘新型次级代谢产物。

笔者系统梳理了核糖体工程技术用于选育优质菌株的相关研究报道,综述了不同诱变方式包括单抗生素诱变、多抗生素诱变和复合诱变的研究进展,为核糖体工程的发展以及微生物优质菌株的选育提供参考。

1 单抗生素诱变

微生物通常在进入生长稳定期后开始合成次级代谢产物,其次级代谢产物生物合成相关基因的表达决定于核糖体,核糖体除表达基因合成蛋白外,还存在多种调节生长代谢的重要位点和多种抗生素结合位点。抗生素抗性机制研究表明:如利福平(Rifampicin,Rif)、链霉素(Streptomycin,Str)、庆大霉素(Gentamicin,Gen)、巴龙霉素(Paromomycin,Par)、夫西地酸(Fusidicacid,Fus)、新霉素(Neomycin,Neo)、氯霉素(Chloramphenicol,Chl)、四环素(Tetracycline,Tel)、林可霉素(Lincomycin,Lin)、红霉素(Erythromycin,Ery)和卡那霉素(Kanamycin,Kan)等抗生素能使微生物产生类似应急反应的现象,从而改变核糖体结构,影响微生物次级代谢产物的调控途径,并能定向提高目标产物合成能力[7-8]。在单抗诱变中,氨基糖苷类和大环内酰胺类抗生素不仅诱变效果好,而且应用广泛。

1.1 氨基糖苷类

1.1.1 链 霉 素

链霉素是核糖体工程中最常用的抗生素之一,其作用位点通常是30S核糖体(核糖体小亚基)上的rpsL基因,该基因编码核糖体蛋白S12。Shima等[9]发现rpsL基因突变导致S12蛋白的结构发生变化,从而使链霉素不能与S12结合,最终让突变菌株表现为对链霉素抗性。这种突变机制同时会使核糖体结构更稳定,翻译的保真度更高[10]。rpsL基因突变不仅激活了变铅青链霉菌(S.lividans)产生放线菌素的基因,而且规避了天蓝色链霉菌(S.coelicolor)中relA和brgA突变以及灰色链霉菌(S.griseus)中relC突变的影响。因为通过研究发现链霉素引起核糖体改变的机制其实与其浓度存在一定的关联,所以目前链霉素引起核糖体改变的机制主要分为2种:高水平耐药性是由rpsL突变引起的;而低水平耐药性是由rsmG突变引起的,rsmG编码1个包含SAM结合基序的16S rRNA甲基转移酶[7]。大量研究表明链霉素引起的突变会提高一些菌株的次级代谢产物产量。Zhuang等[11]采用链霉素对CB03234菌株(Streptomycessp.CB03234)进行改良,成功筛选出1株30S核糖体蛋白S12发生K43N突变的天赐霉素(TNMs)高产链霉菌CB03234-S(Streptomycessp.CB03234-S)。在放大发酵过程中,TNM-A和TNM-A/D的效价分别提高了45倍和100倍,使TNM-A和TNM-D的制备量超过200 mg;刘华华等[12]采用链霉素对绿色产色链霉菌(S.viridochromogenesgs 77)进行抗性选育,获得了1株阿维拉霉素高产突变菌株S.viridochromogenesgs 77-54,其阿维拉霉素的产量为原始菌株的1.8倍,且突变菌株的气生菌丝呈长直形,较为粗壮,孢子为直径约1.1 μm×0.6 μm的椭圆形,与出发菌株区别明显;李芹等[13]通过逐步引入高浓度链霉素的方法筛选到了1株高产ε-聚赖氨酸(ε-Poly-L-lysine,ε-PL)突变株SS-19(S.albulusSS-19),产量达(3.13±0.04) g/L,比原始菌株提高了95.63%;韩晓等[14]以海洋来源无活性放线菌野生株HLF-39和HLF-43为出发菌,分离纯化链霉素抗性突变株,通过抗肿瘤活性筛选获得抗肿瘤活性突变株,从HLF-43突变株CHS-21101发酵物中分离得到2个该突变株新产抗肿瘤活性产物,并分别鉴定为环(4-羟脯-亮)二肽和phencomycin,从而拓展药源放线菌活性菌株新资源。

1.1.2 庆大霉素

庆大霉素是一种氨基糖苷类抗生素,其抗性通常是通过菌体的rplF基因发生突变产生的,rplF基因负责编码30S核糖体中的L6蛋白。L6蛋白位于肽基转移酶中心的氨酰-tRNA结合位点,直接与23S rRNA结合。当微生物菌株的relA基因发生突变时,虽然菌体不能合成ppGpp,其次级代谢产物也不能生产,但是在relA突变株中引入rplF基因突变,获得庆大霉素抗性后,发现突变株在ppGpp合成能力没有恢复的情况下也恢复了产生次级代谢产物的能力,这说明L6蛋白的突变可不依赖ppGpp启动次级代谢产物的合成。基于该原理,庆大霉素也逐渐被用于提高微生物菌株的次级代谢产物产量[10]。Wang等[15]通过核糖体工程技术获得了具有庆大霉素抗性的杨浦分枝杆菌DSM 45577菌株(MY-G-1),突变菌株显示出较高的YPMs产量(7.4 mg/L),成功解决了野生型杨浦分枝杆菌因YPMs产量低(1 mg/L)而阻碍进一步药物开发的问题。

1.1.3 巴龙霉素

巴龙霉素的抗性是通过编码30S核糖体S12蛋白的rpsL基因保守区域的突变,将其第314位的C突变为A,由脯氨酸突变为谷氨酰胺;第320位的C突变为T,由丙氨酸突变为缬氨酸来产生的。邬洋等[16]在10×MIC(最小抑菌浓度)巴龙霉素浓度下,分离得到糖多孢菌的巴龙霉素抗性突变株54株,其中突变体P-7(S.pogonaP-7)的丁烯基多杀菌素产量提高幅度最大,相比原始菌株提高2.2倍;Liu等[17]使链霉菌M-Z18(S.albulusM-Z18)获得巴龙霉素的抗性,抗性突变体的次级代谢产物(ε-聚L-赖氨酸)产量达到了2.59 g/L,较原始菌株产量提高了1.45倍。

1.2 大环内酰胺类

利福平是一种大环内酰胺类抗生素,作用于菌体RNA聚合酶的β亚基,能抑制细菌DNA转录合成RNA,干扰脱氧核糖核酸及蛋白质的合成,从而达到灭菌的目的。利福平的作用机制通常是诱导菌体的rpoB基因发生突变,该突变除了能提高抗生素产量外,还会使RNA聚合酶(RNAP)亚单位中产生某些RPOBM突变(以及核糖体蛋白S12中产生的某些RPSLS突变),这对激活“沉默”次级代谢物生物合成基因有效,最终可能会导致新抗生素的产生。rpoB突变在促进各种放线菌产生抗生素方面广泛有效,并且其激活了次级代谢产物生物合成基因簇,这些基因簇是“沉默的”或在普通培养条件下表达差。rpoB突变在增强抗生素链球菌(S.antibiocus)中的放线菌素产量方面有效,但在微小链球菌中无效,这表明rpoB突变效应的菌株依赖性。该利福平耐药突变方法的特点是其具有可行性,不仅有助于激活和提高代谢物的产量,而且可用于发掘代谢物的生物化学活性[18]。刘正强[19]研究发现在革兰氏阴性细菌荧光假单胞Pf-5(P.protegensPf-5)中引入rpoB基因突变,会导致突变株的代谢水平与原始菌相比有较大差异,突变株R55(P.protegensR-55)的多个代谢产物产量都有一定提高。对出发菌株Pf-5和利福平突变菌株进行DNA序列分析,发现7个抗真菌活性提高的突变菌株都发生了相同的位点突变,在rpoB基因的保守区(rif-clusterI)存在点突变(H53IN)。Thong等[20]从11株放线菌出发,共筛选出164个Rif突变体,并鉴定出1株具有rpoBH437Y突变的TW-R50-13,在TW-R50-13中分离出大量的次级代谢产物,经过结构分析确定其主要成分为3种含甲苯的线性聚酮。使用相同的方法在9种放线菌中共筛选出114Rif突变体,并鉴定出1个链霉菌序列S55-50-5,具有相同的rpoBH437Y突变,经鉴定该菌株产生了一种新型的对受试肿瘤细胞系具有细胞毒性和对金黄色葡萄球菌有抗菌活性的四环聚酮异吲哚霉素。徐祖伟等[21]采用利福平对S.albulusFMME-545进行改良,最终获得了次级代谢产物(ε-聚赖氨酸)产量可达2.42 g/L的突变菌株,较原始菌株产量提高了1.73倍。核糖体工程常用的抗生素如图1所示。

图1 核糖体工程常用抗生素Fig.1 The most common antibiotics used in ribosome engineering

2 多抗生素诱变

近年来,复合抗生素的使用也成为运用核糖体技术提高菌株的次级代谢产物的常用方法之一。基于经典的核糖体工程研究方法,在菌株中依次引入不同类型的抗生素突变能够非常有效地提高其抗生素产量,该方法在提高某些菌株的次级代谢产物方面较使用单一抗生素有着更加显著的效果,并且在产量的提升作用上具有“叠加效应”。此外,诱导联合耐药突变还可能会产生高频率的阳性突变。

2.1 双抗生素

为提高野生菌株的代谢产物产量,研究者们基于核糖体工程菌株选育理念,利用2种抗生素抗性筛选的方法获得高产突变株。Hu等[22]在链霉菌突变体中引入庆大霉素和利福平抗性构建双突变体(str-gen和str-rif),进一步提高了天蓝色放线菌合成放线菌素的产量(约1.7～2.5倍),并通过Western印迹分析,确定在这些双突变体中通路特异性调控蛋白ActII-ORF4的产量显著增加;吴光耀等[23]以1株经过多轮原生质体融合和常压等离子体诱变改造菌S.albulusAS3-14为出发菌,通过相继使用链霉素和利福平进行抗性筛选,获得了双重抗性高产突变株S.albulusWG-608,其ε-聚赖氨酸摇瓶产量达到3.7 g/L,5 L发酵罐补料分批发酵ε-聚赖氨酸产量达到53.0 g/L,较出发菌株分别提高了42.3%和32.5%;王耀耀等[24]采用链霉素和利福平对东方拟无枝酸菌(Amycolatopsisorientails)进行二轮组合诱变,得到一系列具有多样代谢特点的菌株,其中04-102发酵水平较原出发菌株提高45.8%,发酵水平达到145.8 ug/mL,且代谢速度和遗传稳定性都得到显著改善;Campbell等[25]采用利福平和庆大霉素对多黏拟杆菌OSY-DF(PaenibacilluspolymyxaOSY-DF)进行2轮抗性筛选,获得了效价比野生型高出5倍的芽孢杆菌素高产菌株OSY-EC,该菌株具有良好的稳定性和自发性。

2.2 多抗生素

在双重抗生素抗性筛选的基础上,多重抗生素抗性诱变筛选被广泛使用。Hu等[22]在发现了天蓝色放线菌双突变体(Str-Gen和Str-Rif)的高产量后构建了三重突变体(Str-Gen-Rif),发现其具有更高的抗生素生产能力(3.5倍),能够生产比野生型菌株多48倍的放线菌素,且三重突变体产生的放线菌素持续时间(4 d)比单一或双突变体(2 d)长;Wang等[26]通过对蓝链霉菌A3(S.coelicolorA3)连续引入多个耐药突变来获得抗生素高产的菌株,并筛选出分别对7种和8种药物具有耐药性的突变体C7和C8,其聚酮类抗生素放线菌素的产量比野生型高出180倍,证明七元和八元耐药突变能显著激活抗生素生产;汤谷[27]在获得高产突变菌株T3-145(S.diastatochromogenesT3-145)后,使用链霉素、利福平和巴龙霉素对其进行5轮高产四烯大环内酯类抗生素抗性突变株的筛选,得到1株高产突变株G5-59(S.diastatochromogenesG5-59),其四霉素P的产量为3 131 mg/L,是野生型菌株的40倍,四烯菌素B的产量为1 033 mg/L,是野生型菌株的29倍,四霉素A的产量为768.9 mg/L,是野生型菌株的13倍;Shentu等[28]对S.diastatochromogenes1628引入多重抗性获得三重抗性突变株SD3145(Str Str Par),发酵优化后其丰加霉素的产量最高达2 664 mg/L,可用于改善丰加霉素的工业化生产。

3 复合诱变

单因子诱变虽然有一定的效果,但是往往不够理想。多因子复合诱变能从不同角度引起菌株遗传物质的改变,具有“叠加效应”[16],将核糖体工程与基因编辑技术[29]和发酵优化[30]方法相结合可以更高效地提高诱变效率和菌株产量。

3.1 双重复合法

将传统的理化因子诱变育种方法与抗性基因突变筛选结合,通过大幅度淘汰野生型并浓缩突变型来提高筛选效率,可以在很大程度上克服诱变随机筛选的盲目性和不定向性,具有广谱性、正突变率和增产百分率高等特点[31]。郑根成等[32]借助基因组重排和核糖体工程两种育种手段强化ε-PL产生菌的合成能力,最终经过4轮基因组重排和4轮核糖体工程连续选育,获得1株高产突变株S.albulusGS114,其摇瓶ε-PL产量达到3.0 g/L,较出发菌提高了1.7倍;刘娟娟等[33]通过CRISPR-Cas9系统成功构建了没有任何抗性标记的新型CAM工程菌株54IA-1(S.spiramyceticus54IA-1)和54IA-2(S.spiramyceticus54IA-2),并进一步通过核糖体工程技术对构建成功的CAM工程菌株进行菌种诱变,筛选获得新型可利霉素(Carrimycin,CAM)高产菌株,为CAM工程菌株的优化奠定了基础;乔长晟等[34]以刺糖多孢菌GYLZ 88912为出发菌,采用常压室温等离子体(ARTP)诱变,并通过核糖体工程筛选出1株具有磺胺胍、利福平、链霉素和红霉素多重抗性的高产菌,其多杀菌素的产量为2 361.81 mg/L,较出发菌株提高了286.71%;Li等[35]采用基因重组与多种抗生素耐药性相结合的育种方法,从小单胞杆菌LS-1(BacilluspumilusLS-1)出发,在第三轮重组中获得了高产菌株GS3-M7,并在后续发酵中测得其聚-L-二氨基丁酸产量达2 316.4 mg/L;郑明坤等[36]首先通过链霉素抗性筛选,获得1株产抗能较高菌株,以等离子体处理40 s,借助巴龙霉素抗性筛选后,重复诱变筛选最终获得1株MicromonosporainyoensisSAAP22,其西索米星合成能力比出发菌株效价提高了38.18%,且具有稳定的遗传性能。

3.2 多重复合法

多重复合法可更有效地进行诱变并获得目标菌株。石漫漫等[37]以通过常压室温等离子体诱变筛选出的高产游动放线菌为出发菌株,首先进行紫外诱变并联合核糖体工程进行诱变;然后进行发酵复筛;最后得到的游动放线菌的雷帕霉素产量可达到589.79 mg/L,较出发菌株的产量256.86 mg/L提高了129.61%,且遗传稳定性良好。Tong等[38]通过对维吉尼亚链霉菌进行紫外线照射和微波照射产生起始突变体群体,再通过连续5轮基因组重组联合链霉素耐药性筛选,获得了基因表达稳定的菌株G5-103(S.virginiaeG5-103),其链霉菌维吉霉素(VGM)产量达251 mg/L,是野生型菌株CICC11013(S.virginiaeCICC11013)的11.6倍。王欣荣等[39]以游动放线菌SIIA-1602(ActinoplanesSIIA-1602)作为出发菌株,将NTG诱变、核糖体工程育种和常压室温等离子体方法结合,筛选得到突变株ASN-256(ActinoplanesASN-256),发酵效价达到615 μg/mL,比出发菌株提高了55.7%。Li等[40]结合紫外线诱变、核糖体工程以及发酵优化等,从链霉菌DengpaensisXZHG99T出发获得了4个链霉素突变体,并通过基因筛选、HPLC/LC-MS分析后获得高产菌株,其拉贝霉素和沙奎霉素B1的最大效价分别达到15.7,39.9 mg/L,比XZHG99T的初始效价分别高出约8倍(拉贝霉素)和11倍(沙奎霉素B1)。近5年来利用核糖体工程技术提高目标产物效价的研究情况如表1所示。

表1 利用核糖体工程技术提高目标产物效价情况表(2017—2021年)

4 结论与展望

核糖体工程技术操作虽然简单且应用广泛,但仍然存在许多不足,主要表现为2个方面:一是相较于传统的物理和化学诱变方法,核糖体工程作用靶点虽然更加明确,但仍然存在着一定的随机性,相同的突变对不同的产物也可能有相反的影响,因此,不可避免地需要进行繁杂且冗长的抗性诱变以及筛选等;二是目前大多数抗生素的作用靶点和具体改变微生物次级代谢能力的机制仍比较模糊,缺少系统的相关研究和机理模型,导致核糖体工程效率较低。因此,核糖体工程技术仍有待进一步的发展完善,可通过发掘更多可用抗生素、深入解析抗生素的作用机制及确定对应的作用靶点、利用菌株基因组信息为指导快速筛选目标突变菌株等方法来实现。在后基因组时代,分析技术得到了广泛应用,越来越多微生物合成次级代谢物的巨大潜力被发现,综合运用核糖体工程、基因工程和生物信息学等技术必将促进优质菌株的高效选育,并提高其次级代谢产物的合成能力。