静脉血栓栓塞患者循环细胞外DNA 变化及其临床意义

张元莉 路彩霞 董素敏 孙美兰

1.石家庄市人民医院心血管内科二病区，河北石家庄 050011；2.河北省沧州中西医结合医院急诊科，河北沧州 061000；3.河北省沧州中西医结合医院介入血管外科，河北沧州 061000；4.石家庄市人民医院建安病区，河北石家庄 050011

静脉血栓栓塞症是指血液在静脉中的不正常凝结，使静脉管腔阻塞，导致静脉回流障碍，主要包括肺血栓栓塞和深静脉血栓栓塞，是继脑卒中和心肌梗死后第三大常见的心脑血管疾病[1-2]。静脉血栓栓塞症发病隐匿，80%左右的患者临床症状不明显，有高误诊率、高漏诊率的特点[3]，且血栓形成后极少数能自行消融，大多会逐渐演变为血栓形成后遗症，长期影响患者的生活质量，严重者可导致死亡[4-5]。因此，寻找静脉血栓栓塞症的有效评估指标以指导临床治疗、改善预后是临床亟须解决的问题。有研究发现，中性粒细胞外诱捕网与静脉血栓栓塞有着密切的关系，其独特的网状结构可为血栓的形成提供支架，促进血栓形成[6]。而血浆中游离脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）是中性粒细胞外诱捕网的主要成分，有研究报道老年骨折深静脉血栓栓塞患者的循环DNA 水平明显高于骨折未并发深静脉血栓栓塞患者[7]，提示循环DNA 可能在深静脉血栓栓塞形成中有着重要作用。基于此，本研究采用荧光定量聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）技术检测静脉血栓栓塞症患者循环细胞外DNA 水平，并探讨其与静脉血栓栓塞症病情严重程度的关系，旨在为临床评估治疗提供新方向。

1 资料与方法

1.1 一般资料

经医院伦理委员会审批后（批准文号：201904-002），选取石家庄市人民医院（以下简称“我院”）2019 年5 月至2021 年5 月收治的107 例静脉血栓栓塞患者作为疾病组，同期选取我院体检科110 名健康体检者作为对照组。对照组男69 例，女41 例；年龄45～73 岁，平均（57.36±5.18）岁。疾病组男65 例，女42 例；年龄46～73 岁，平均（56.14±5.21）岁；肺血栓栓塞23 例，深静脉血栓栓塞84 例，其中深静脉血栓栓塞发生左下肢57 例、右下肢24 例、双下肢3 例；合并冠心病10 例，合并高血压36 例，合并糖尿病14 例。两组性别、年龄比较，差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。

纳入标准：①疾病组符合深静脉血栓形成[8]和肺栓塞诊断标准[9]；②对照组经体检确认健康；③年龄18～75 岁；④患者及家属对本研究知情并签署知情书。

排除标准：①有肾衰竭、肝硬化等重大器官疾病；②患恶性肿瘤；③已使用过溶栓、抗凝类药物；④有血液系统性疾病；⑤免疫性疾病及急性感染。

1.2 循环细胞外DNA 水平的检测

血浆样本的采集：于对照组体检当日、疾病组治疗前采集空腹外周无菌静脉血5 ml 于EDTA 抗凝采血管（北京科美信生物有限公司）中，将血样置于TDL-5-A 低速离心机（上海仪天科学仪器有限公司）3 000 r/min离心15 min，离心半径15 cm，弃去上层血清，再于TGL-16G 高速离心机（上海仪天科学仪器有限公司）中12 000 r/min 离心10 min，离心半径15 cm，将血浆分装为每管200 μl，统一储存于-80℃冰箱中。

循环DNA 水平的测定：取以上200 μl 血浆样本解冻，按照血浆DNA 提取试剂盒（美国Epigentek 公司，货号：70404-20）的说明进行操作提取DNA，加入180 μl 荧光染料工作液混匀，另取10 μl DNA 浓度测定试剂盒（北京索莱宝科技有限公司）提供的标准品溶液与190 μl 荧光染料工作液混匀。用Varioskan LUX 多功能酶标仪（赛默飞世尔科技有限公司）进行测定（激发光波长480 nm，发射光波长530 nm），根据建立的标准曲线和标准品的荧光值计算出样品中的游离DNA 浓度。

1.3 病情严重程度判定

肺血栓栓塞严重程度判定：采用CT 肺动脉造影检查，将动脉阻塞程度＜25%、≥25%且＜50%、≥50%且＜75%、≥75%且＜100%、100%分别分为1～5 级，各级的分值分别为1～5 分，统计1～5 级阻塞程度的总分，计算肺动脉指数（pulmonary artery index，PAOI），PAOI=（1～5 级阻塞程度的总分）/155。按照相关标准[10]，根据PAOI 将肺血栓栓塞患者分为轻度组：PAOI＜30%；中度组：30%≤PAOI＜50%；重度组：PAOI≥50%。

深静脉血栓栓塞严重程度判定[11]：血管腔没有被压扁者得2 分，部分压扁者得1 分，完全被压扁者得0 分；血管腔血流完全缺损者得2 分，部分出现缺损者得1 分，血流充盈者得0 分；频谱形态出现明显异常者得2 分，部分异常者得1 分，频谱形态正常者得0 分。总分≤2 分为轻度，3～4 分为中度，≥5 分为重度。

1.4 观察指标

比较两组血浆循环细胞外DNA 水平；比较疾病组不同严重程度患者血浆循环细胞外DNA 水平；分析循环细胞外DNA 水平与静脉血栓栓塞严重程度的关系。

1.5 统计学方法

采用SPSS 26.0 软件对所得数据进行统计学分析，计量资料采用均数±标准差（）表示，比较采用t检验；计数资料采用例数和百分率表示，比较采用χ2检验；采用Spearman 秩相关分析循环细胞外DNA水平与静脉血栓栓塞严重程度的关系。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组血浆循环细胞外DNA 水平比较

疾病组血浆循环细胞外DNA 水平高于对照组（P＜0.05）。见表1。

表1 两组血浆循环细胞外DNA 水平比较（ng/ml，）

表1 两组血浆循环细胞外DNA 水平比较（ng/ml，）

2.2 疾病组不同严重程度患者血浆循环细胞外DNA水平比较

疾病组107 例静脉血栓栓塞症患者中，轻度栓塞51 例，中度栓塞43 例，重度栓塞13 例。三组循环细胞外DNA 水平比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。中度组和重度组循环细胞外DNA 水平均高于轻度组，重度组循环细胞外DNA 水平高于中度组（P＜0.05）。见表2。

表2 疾病组不同严重程度患者血浆循环细胞外DNA 水平比较（ng/ml，）

表2 疾病组不同严重程度患者血浆循环细胞外DNA 水平比较（ng/ml，）

注 与轻度组比较，aP＜0.05；与中度组比较，bP＜0.05

2.3 循环细胞外DNA 水平与静脉血栓栓塞严重程度的关系

Spearman 秩相关分析结果显示，循环细胞外DNA水平与静脉血栓栓塞严重程度呈正相关（r=0.866，P＜0.05）。

3 讨论

静脉血栓栓塞症对人类健康有着严重的威胁。据西方国家的相关统计，每16 秒就有一个人发生静脉血栓栓塞，每年死亡人数超过80 万人[12-13]。静脉血栓栓塞患者症状表现轻重不一，缺乏特异性，目前多普勒超声以无创、易行的特点在临床中应用最多，但不能动态观察血栓的形成情况[14-15]。肺动脉造影是诊断评估静脉血栓栓塞症的金标准，但由于有创且需要使用造影剂，实际应用时经常会受到限制[16]。因此，寻找一个准确、客观的检测指标来评估静脉血栓栓塞症患者疾病严重程度是临床上亟待解决的问题。

本研究中发现疾病组循环细胞外DNA 水平较对照组升高，提示循环细胞外DNA 水平与静脉血栓栓塞的发生有关。循环细胞外DNA 是血浆中游离的双链DNA，广泛存在于人体的血液中，可促使凝血活化、诱导血小板发生聚集，并对纤维蛋白的溶解有抑制作用[17-18]。Jiménez-Alcázar 等[19]研究发现，老年静脉血栓栓塞患者循环细胞外DNA 水平与健康者相比明显升高，可作为老年静脉血栓栓塞患者死亡率的预测因子。本研究结果与之相符，证实了循环细胞外DNA 水平和静脉血栓栓塞的形成密切相关。此外，本研究还发现静脉血栓栓塞不同严重程度患者的循环细胞外DNA 水平比较，差异有统计学意义（P <0.05），中度组和重度组循环细胞外DNA 水平均高于轻度组，重度组循环细胞外DNA 水平高于中度组，且进一步进行Spearman 分析显示循环细胞外DNA 水平与静脉血栓栓塞严重程度呈正相关，提示循环细胞外DNA 水平可作为评估静脉血栓栓塞严重程度的指标。Klopf等[20]研究发现，中性粒细胞外诱捕网可活化内皮细胞中的金属蛋白酶，致使内皮细胞损伤，进而促进血栓的形成。中性粒细胞外诱捕网与静脉血栓栓塞的发生存在密切的关系，其参与血栓的形成主要跟凝血因子、内皮损伤等有关，还能与血栓蛋白C 和调节蛋白结合，抑制蛋白活化参与血栓的产生[21-23]。Hashimoto等[24]在活动性疾病患者中发现中性粒细胞-血小板聚集频率增加，可导致高浓度地循环细胞外DNA，造成血栓的形成和发展。另有研究报道[25]，血浆中DNA 含量和与血栓形成密切相关的中性粒细胞外诱捕网标志物的升高趋势具有一致性，且具有微创性、标本获取方便等优点。循环细胞外DNA 是中性粒细胞外诱捕网的骨架，可为血小板的黏附提供支架，并能促进纤维蛋白的沉积，加固血液凝块，诱导血液淤滞，其水平越高则反映血液凝滞越严重，进而也提示了静脉血栓栓塞也严重[26]。故建议临床可通过检测静脉血栓栓塞症患者循环细胞外DNA 水平来评估病情来指导临床治疗。

综上所述，静脉血栓栓塞患者循环细胞外DNA水平较正常人群异常升高，且与静脉血栓栓塞严重程度呈正相关，随疾病严重程度的增加而升高，提示循环细胞外DNA 水平可作为评估静脉血栓栓塞严重程度的指标。但目前循环细胞外DNA 的确切来源还存在一些争议，在炎症、创伤等疾病也能检测到循环DNA 浓度的升高，容易造成假阳性，关于循环细胞外DNA 水平在静脉血栓栓塞症中的临床意义还需长期深入研究。