猕猴桃园区坡度和晴雨天对猕猴桃溃疡病传播的影响

汪 华，邓思怡，刘 军，常 威，程杰元，陈 琦，喻大昭#

（1. 湖北省农业科学院植保土肥研究所，武汉430064；2. 华中作物有害生物综合治理重点实验室，武汉430064；3. 浠水县农业技术推广中心植保站，浠水438200；4. 赤壁神山兴农科技有限公司，赤壁437300）

中国是猕猴桃原产地和世界上最大的猕猴桃生产国和消费国[1,2]。以“红阳”品种为主的红心猕猴桃因其口感和品质深受市场青睐。但该品种易感由丁香假单胞菌猕猴桃致病变种（Pseudomonas syringaepv.actinidiae，Psa）引起的溃疡病[3-5]。该病害具有发生范围广、传播迅速和防治难度大等特点[6]，在我国16个省份已造成严重危害[7,8]，成为制约猕猴桃产业发展的重要问题。国内外已从病原学、发生规律和治理办法等多方面对该病进行了研究。已有的结果表明该病病菌可在病株枝干、叶、芽、叶痕和田间病残体上越冬，成为翌年初侵染源[9,10]。病菌主要借风、雨、昆虫传播，通过自然孔口和伤口侵染寄主[11]。其发展与温度和湿度关系密切[12]。Serizawa和Ichikawa[13]研究表明春季旬平均气温在12 ℃～18 ℃时，病害发生严重，而气温超过25 ℃时，新病斑仅在阴凉雨湿条件下发生。但未见雨天是否促进猕猴桃溃疡传播的报道。另外，前期猕猴桃园区调查发现，园区陡坡区域的猕猴桃溃疡病流行较为严重。为明确露地栽培猕猴桃园区坡度和晴、雨天对猕猴桃溃疡病传播的影响。本研究于2020年4月和2021年3月在猕猴桃园区的不同坡度区域和晴、雨环境下利用孢子捕捉器开展病原捕集试验，记录猕猴桃树叶片显症所需时长，以此反映不同条件对病害传播的影响，为该病的防治提供依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

试验品种为“红阳”红心猕猴桃。植物基因组DNA提取试剂盒和DNA胶回收试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司。中农简易病菌孢子捕捉器由中国农业大学植物病害流行学实验室研制，专利号：ZL201410009269.6[14]。其进气仓直径10 cm、高度10 cm，顶部设有8个进气孔，进气孔长3 cm、宽1 cm，捕捉仓直径10 cm、高度10 cm、底座长12 cm、宽12 cm、高5 cm，底部风扇直径8 cm，出风口为下方，锂电池组（12 V，30 AH）供电装置由深圳市劲风科技有限公司生产。

1.2 猕猴桃园区基本情况调查

2020年4月14日对湖北省赤壁市半岛南猕猴桃园区18个种植红阳猕猴桃的棚区的栽培模式、地形环境以及溃疡病的病情指数和病株率进行了调查。病情分级标准如下：0级：全株无明显病斑；1级：只有叶片可见明显病斑，且病斑面积均未超过10%；2级：叶片、枝条均有明显病斑，但病斑环绕枝条15%以下，主干无病斑或病斑面积低于25%；3级：枝条、叶片和主干均有明显病斑，且主干病斑面积在25%～50%；4级：全株发病或死亡，或主干病斑面积高于50%。

1.3 猕猴桃溃疡病菌捕集试验

2020年4月16—22日和2021年3月24—30日，根据发病情况和地势环境，在10号棚架内选择了4块试验地作为4个处理（如表1所示）。每处理设置3台孢子捕捉器作为3个重复。蓄电池固定在猕猴桃植株中间的水泥支柱上，捕捉器固定在蓄电池上（图1），捕捉器上部有进气仓，下部有捕集仓，底部有风扇，将仪器周围的空气吸入仓内，使病原菌落到健康叶片上。

表1 孢子捕捉器在猕猴桃园内不同地势摆放坡度及排布方式Table 1 Slope and arrangement of pathogen traps in different terrains in kiwi orchard

图1 孢子捕捉器在猕猴桃园区不同地势的摆放位置Fig. 1 Trap positions in each treatment in different terrains in the orchard

猕猴桃溃疡病菌捕集操作步骤：（1）早上7点左右，在“红阳”猕猴桃试验棚，用75%酒精消毒的剪刀，采集大、小叶位一致的健康猕猴桃叶片备用；在室内用0.5%次氯酸钠溶液浸泡叶片1 min，无菌水漂洗两遍，灭菌纱布吸干叶片表面水分，将叶柄剪至1 cm长，用2 cm×3 cm的灭菌纱布将叶柄部位包住，备用。（2）将双层无菌滤纸放入直径9 cm的塑料培养皿中，添加无菌水至滤纸润湿。然后，将步骤1处理好的叶片放入其中。（3）将孢子捕捉器底部电源断开，打开捕捉器进气仓，将盛放有上述叶片的培养皿置于捕捉器仓底部，盖上进气仓，接通电源。（4）孢子捕捉器捕集24 h后，取出培养皿中叶片，放入有无菌湿润滤纸的磁盘中，同时用健康猕猴桃叶片做阴性对照。磁盘上用透明封口膜保湿。当叶片出现褪绿小点或不规则的褐色斑点，斑点周围有黄色晕圈且黄色晕圈连续3 d扩大时，把第1 d观察到黄色晕圈的时间定义为开始显症时间，把该时间与叶片采集日之间的时间差定义为显症所需时长。（5）把确定显症所需时长后的叶片用干滤纸将叶片分开包裹，放入自封袋中，置于4 ℃冰箱保存，用于后续显症叶片的病原菌分子鉴定，以确认该病斑为由溃疡病菌所致。（6）连续7 d，记录当日天气情况，包括温度、湿度、晴雨天。

1.4 溃疡病斑的分子鉴定

用植物基因组DNA提取试剂盒提取猕猴桃显症叶片和健康叶片（阴性对照）的DNA。利用猕猴桃溃疡病菌特异性引物（上游引物PsaF1：5′-TTTTGCTTTGCACACCCGATTTT-3′和下游引物PsaR2：5′-CAC GCACCCTTCAATCAGGATG-3′）[15]鉴定猕猴桃发病叶片是否为溃疡病菌所致。PCR反应体系总体积25 μL:无菌水9.5 μL，Master mix 12.5 μL，DNA 1.0 μL，引物 PsaF1/PsaR2各 1.0 μL。PsaF1/R2进行 PCR 扩增条带大小为280 bp。PCR扩增反应程序为：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，65 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30个循环；72 ℃再延伸5 min。分别对其PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶检测。PCR扩增片段送至生工生物工程股份有限公司进行测序，经测序得到的序列在 NCBI 网站上进行Blast检索比对。

1.5 数据统计与分析

利用Microsoft Office Excel软件对各试验所得数据进行整理和作图，获得平均值和标准误。利用SPSS 23.0数据处理软件进行方差分析，利用邓肯氏新复极差法（DMRT）进行差异显著性分析（P＜0.05）。

2 结果与分析

2.1 猕猴桃园区基本情况调查

为了选取合适的试验区域，对所选猕猴桃园区的地势和溃疡病发病情况进行了调查。结果显示园区发病棚区病情指数低于30的有4个，介于30～50之间的棚区有6个，超过50的棚区有8个（表2）。其中，8、16、17和18号的区域为平地，病情指数均明显低于有斜坡区域，表明不同地势可能影响病害的传播。本试验选择靠近路边，方便通行，植株长势一致，且包括不同坡度的10号棚架作为后续试验区域。

表2 猕猴桃园区情况调查Table 2 Investigation of the kiwifruit orchard

2.2 坡度对猕猴桃溃疡病菌传播的影响

2020年和2021年对猕猴桃园区试验地的坡顶和坡底（10°）、坡上（45°）和坡下（30°）进行病原菌捕集，结果均表明在坡底和坡顶（10°）进行病原捕集的猕猴桃叶片显症所需时长比在坡上（45°）和坡下（30°）进行病原捕集的猕猴桃叶片显症所需时长长1～2 d（图2A，B），表明30°至45°陡坡区域有利于猕猴桃溃疡病的传播。

图2 不同坡度捕集病原菌的猕猴桃叶片显症所需时长Fig. 2 Length of time necessary to show symptoms in kiwi leaves placed inside pathogen traps at different slope areas

2.3 晴、雨天对猕猴桃溃疡病传播的影响

2020年和2021年分别连续7 d调查了天气情况对发病的影响结果表明，2020年4月18日和4月20日雨天导致温度低湿度高，猕猴桃叶片7～8 d即可发病，而晴天猕猴桃叶片显症所需时长为10～12 d（图3A）。2021年3月27日、3月29日和3月30日雨天也表现出同样的结果（图3B）。因此，表明雨天导致的低温高湿环境利于溃疡病的传播。

图3 晴、雨天捕集病原菌的猕猴桃叶片显症所需时长Fig. 3 Time length necessary to show symptoms in kiwi leaves placed inside pathogen traps on sunny and raining days

2.4 猕猴桃显症叶片的病原菌分子鉴定

通过猕猴桃溃疡病菌特异性引物Psa F1/Psa R2 进行的PCR检测结果表明，作为阴性对照的健康叶片DNA未扩增出条带，显症叶片DNA则扩增出280 bp大小的条带。对所有扩增条带进行测序，并经与NCBI数据库进行Blast检索比对，结果显示所有发病叶片为Psa侵染所致。

3 讨论

有研究表明，雨水可能是猕猴桃溃疡病菌中短距离传播的重要途径[11,16,17]，但并没有量化研究。本研究通过病原捕集，并以叶片显症所需时长明确了雨天环境对猕猴桃溃疡病传播的影响，证明雨天进行病原捕集后叶片显症所需时长最短（7～8 d）。而晴天回收的叶片，显症时长通常为10～12 d。其原因可能在于雨天利于溃疡病菌的增殖，群体数量增加后致传播量加大。但也可能与雨水促进了病原菌的定殖和侵染有关。无论如何，雨水是可以促进该病的扩散。因此，避雨栽培应可能成为猕猴桃溃疡病防控的有效手段。地势较为平坦的棚架发病情况和病株率相对较轻，进行病原捕集的猕猴桃叶片显症时间较长。试验中，在坡底（10°）进行病原捕集的猕猴桃叶片显症所需时间最长，而在45°陡坡进行病原捕集的猕猴桃叶片显症所需时间最短。这可能是因为陡坡比平地接收了更多风带来的病原菌，并在叶片上集聚，增加了病原菌的接种势。因此，地形上的隔离对该病的防控有一定的意义。本研究首次借助孢子捕捉器直接证实了园区陡坡区域和雨天环境可以促进猕猴桃溃疡病的流行，为后续防治方法和防治策略的制订提供了依据。