向日葵菌核病拮抗木霉菌筛选及防病效果

陈玉蓉，曹秋林，廉 华，马光恕，蒋细良，李 梅*

（1. 中国农业科学院植物保护研究所/农业部作物有害生物综合治理综合性重点实验室，北京 100193；2. 黑龙江八一农垦大学园艺园林学院，大庆 163319）

向日葵是重要的油料作物，在我国的栽培面积仅次于大豆、油菜和花生。随着对向日葵籽粒及其副产品的需求不断增加，其种植面积也逐年加大。向日葵菌核病是由核盘菌Sclerotinia sclerotiorum（Lib.）de Bary侵染引起的一种土传病害[1]，在世界范围内普遍发生。该病菌寄主范围广泛，除向日葵外，还危害大豆、油菜、花生、菜豆、甘蓝、葱、胡萝卜、苜蓿等[2]，主要以抗逆性强的菌核在土壤中越冬，春天萌发形成菌丝侵染寄主根茎部，或在条件适宜时，菌核萌发产生子囊盘释放子囊孢子，侵染植株地上部的叶片、茎秆和花盘[3]。在中国东北和内蒙古等产区，因菌核病造成向日葵的平均发病率达到 40%～60%，最高可达到90%以上，严重危害向日葵种植业的发展[4]。随着化学农药防治菌核病导致的环境污染、抗药性和药害等问题日益突出，筛选和利用生防微生物防治向日葵菌核病，对于保障向日葵安全生产、保护环境有重要的意义，并受到广泛关注。迄今已报道了链霉菌[5]、枯草芽胞杆菌Bacillus subtilisS-16[6,7]、蜡状芽胞杆菌B. cereusCF4-51[8]、辣椒溶杆菌Lysobacter capsicaXRK5[9]等多株对向日葵菌核病具有高效拮抗作用的生防菌株。朱林等[5]筛选了2株链霉菌和3株芽胞杆菌对葵花菌核病的防治效果范围为57.1%～79.1%，复合菌剂的防治效果可达到81%以上。李小娟[8]报道了一株蜡状芽胞杆菌B. cereusCF4-51，对向日葵菌核病的室内离体叶片测定防效为85.3%，盆栽和大田防效分别达到了78.4%和64.6%。王春等[10]筛选出木霉M1M2菌株对向日葵菌核病菌的生长抑制率为82.6%，盆栽防效为73.8%，田间防效为60%。木霉Trichodermaspp.对植物病原真菌具有广谱的拮抗能力，能通过竞争、抗生、重寄生、诱导植物抗病性等机制防治真菌病害，特别是对土传病害具有良好的防治效果，已有多株木霉菌被开发用于土传病害防治[11,12]。本研究通过对来自内蒙古、新疆地区的木霉菌株进行筛选，并开展防治向日葵菌核病试验，获得了3株具有较高防治效果的木霉菌，报道如下。

1 材料与方法

1.1 供试材料

1.1.1 供试菌株 向日葵菌核病菌S. sclerotiorum（Lib.）de Bary从向日葵菌核病病株腐烂花盘上分离、纯化和鉴定。木霉菌株从内蒙古和新疆地区的森林和草原土壤中分离并鉴定，均由中国农业科学院植物保护研究所木霉组保存，菌株信息见表1。

表1 本研究的12株木霉菌菌株Table 1 Trichoderma strains used in this study

1.1.2 供试向日葵 丰葵杂1号，由中国农业科学院植物保护研究所廊坊试验基地提供。

1.1.3 培养基 马铃薯葡萄糖琼脂固体培养基（PDA）：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂粉20 g，蒸馏水1000 mL，pH 7.0～7.2，121℃高压蒸汽灭菌30 min，冷却后备用。马铃薯葡萄糖液体培养基（PD）为不含琼脂的液体PDA培养基。高粱粒用蒸馏水浸泡4 h后，倒掉水分，采用121℃高压蒸汽灭菌30 min，制备高粱粒培养基[13]，采用相同方法制备大米培养基。

1.2 木霉培养及菌剂制备

将木霉接种于PDA培养基上，28 ℃下活化培养3 d，从菌落边缘取直径5 mm的菌饼5块，接种在含有100 mL马铃薯葡萄糖液体培养基（PD）的 250 mL 的三角瓶中，在28 ℃黑暗条件下振荡培养7 d（250 r/min），发酵液经4层纱布过滤后再用0.4 μm滤膜过滤获得上清液，用于离体叶片检测。将木霉菌饼接种到灭菌的大米培养基上，25 ℃下培养5～7 d，每天翻动使病菌均匀生长，待大米粒表面长满孢子后，过300目筛，获得孢子粉剂，保存于4 ℃备用。用血球记数板统计孢子含量，用无菌水稀释到1.0×107CFU/mL孢子悬液用于盆栽试验和田间试验。

1.3 病菌活化培养和制备

参考王春等[11]的方法，将向日葵病原菌在PDA培养基上活化培养5 d，取直径5 mm的菌饼接种到高粱粒培养基中，25 ℃下培养，每天翻动使病菌均匀生长，待菌丝长满高粱粒表面，保存于4 ℃备用。

1.4 平板对峙试验

木霉接种于PDA平板，28 ℃培养3 d；向日葵菌核病菌接种于PDA平板，28 ℃培养5 d。用打孔器分别从木霉和菌核病菌的菌落边缘打取直径5 mm的菌饼，在PDA平板的一侧接入木霉菌饼，相对另一侧接入病原菌菌饼，菌饼距平板边缘1 cm，平板置于28 ℃培养。以仅接种病原菌为对照，5次重复。培养5 d后测量菌核病菌的菌落半径，参照刘增亮等[14]的方法，计算木霉对病原菌的生长抑制率。抑制率（%）＝（对照组菌落半径－处理组菌落半径）/对照组菌落半径×100。

1.5 离体叶片筛选

选取对病原菌生长抑制作用最强的木霉菌3株，采用离体叶片法对其进行防效测定[15]。挑选叶龄一致的向日葵真叶，用无菌水冲洗两次，晾干后备用。将叶片在PD木霉菌发酵滤液中浸泡30 s，取出后在超净台中自然晾干，放置在水琼脂培养基上，在叶片中央接种直径5 mm的病原菌菌饼，以PD培养基浸泡叶片30 s再接病原菌菌饼为对照，每个处理10个叶片，重复3次，置于25 ℃恒温培养箱中培养，每天拍照记录发病情况。利用ImageJ图像处理软件扫描并计算病斑面积和防治效果。防治效果（%）=（对照平均病斑面积－处理平均病斑面积）/对照平均病斑面积×100。

1.6 盆栽试验

将营养土和蛭石按照4:1均匀混合，装入塑料育苗盆（11 cm×11.5 cm×11.5 cm）中，每盆装土量300 g。向日葵种子催芽后，每盆播种2粒，出苗后每盆保留一棵，置于阳光充足的地方。试验设5个处理：（1）播种前5 d用木霉孢子悬液100 mL/盆拌土+接种菌核病菌前2 d用等量的木霉孢子悬液灌根，设为拌土+灌根处理；（2）播种前5 d用木霉菌悬浮液200 mL（孢子量2×109）/盆拌土，设为拌土处理；（3）待植株长出4片真叶即播种后20 d接种菌核病菌，接种病菌前2 d用200 mL/盆木霉菌悬浮液灌根，200 mL（孢子量2×109）/盆，设为灌根处理；（4）单独利用向日葵菌核病菌灌根且不施用木霉悬浮液，设为病菌对照B。播种前5 d和接病原菌前2 d处理的液体总量均通过补加无菌水补足到200 mL。每个处理设60盆，重复3次。病菌接种采用无菌牙签，挑取直径2 mm的病原菌菌饼，扎到向日葵植株茎基部，接种后48 h内保持环境湿度100%。病菌接种后第6 d开始记录发病情况，计算植株发病率、病情指数和防治效果。

向日葵菌核病分级标准参照陈娴等[16]方法，分为5级：0级表示无病；1级表示病斑面积占全叶10%以下；2级表示病斑面积占全叶11%～30%；3级表示病斑面积占全叶31%～50%；4级表示病斑面积占全叶51%以上。植株发病率为接种后15 d各处理发病株数占调查总株数的百分比。病情指数参照宗兆锋等[17]的计算方法。防治效果（%）=（对照病情指数－处理病情指数）/对照病情指数×100。

1.7 小区试验

每个小区面积66.7 m2，种植10垄向日葵，株距0.60～0.61 m，行距0.61～0.62 m，共计175～180株，3次重复，随机排列。木霉处理分别设为BN862、BN246和BX102。木霉施入采用播种时拌土，按照108CFU/株的孢子用量与50 g土混合作为底肥施入，在向日葵4片真叶时按108CFU/株的孢子用量灌根处理一次，同时接种病菌，将高粱粒培养扩繁的长满菌丝的菌核病菌种200 g，与2倍土壤混合，每11.5 m长垄沟内撒入600 g混合菌种。2周后再次木霉孢子悬液灌根处理一次。9月中旬调查发病率、病情指数和防效。

1.8 数据统计与分析

试验数据采用DPS7.5软件进行统计和分析。

2 结果与分析

2.1 平板对峙试验筛选拮抗菌

将供试木霉与向日葵菌核病菌对峙培养，接种5 d后检测菌落生长抑制率，在检测的12株木霉中，3株木霉菌X102、N862和N246对病菌生长的抑制率达到85%以上，分别为91.22%、90.27%和87.87%（图1，2）。选取上述3株木霉进行下一步的离体叶片检测。

图1 木霉对向日葵菌核病菌生长的抑制作用Fig. 1 Inhibition effects of 12 Trichoderma strains on the growth of Sclerotinia sclerotiorum

图2 木霉与向日葵菌核病菌平板对峙试验Fig. 2 Trichoderma strains confrontation against S. sclerotiorum

2.2 离体叶片试验筛选高效菌株

向日葵离体叶片用木霉发酵液处理后，接种菌核病菌，3 d后观察叶片发病情况（图3），测定病斑面积，计算木霉处理对菌核病的抑制效果。N246、N862和X102对病斑扩展的抑制率分别为90.62%、96.46%和63.84%，显示3株木霉的代谢产物对葵花菌核病菌均具有较强的抑制作用。说明木霉可通过产生抑菌的代谢产物抑制葵花菌核病，并且N246和N862代谢产物的抑制作用高于X102。

图3 木霉防治葵花菌核病的离体叶片试验Fig. 3 Efficacy of three Trichoderma strains on S. sclerotiorum on detached sunflower leaves

2.3 木霉防治向日葵菌核病盆栽试验

3株供试木霉均对向日葵菌核病表现出一定的防治效果，N862单独灌根处理防病效果显著高于单独拌土处理，N246与N862相反，而X102的单独拌土和灌根处理的防效相当，并显著低于拌土+灌根处理。N862、N246和 X102的拌土+灌根处理的防病效果均高于单独的拌土和灌根处理，防效分别为 86.97%、76.72%和73.30%，并且N862的防效高于N246和X102（表2）。

表2 木霉对向日葵菌核病的盆栽试验防效Table 2 Effects of three Trichoderma strains on sunflower sclerotinia rot in pot trials

2.4 田间小区试验防治效果

N862、N246和X102对病害的田间防效分别为67.54%、49.96%和49.23%，N864的防效显著高于N246和X102，并且N246和X102的防效差异不显著（表3）。

表3 木霉防治向日葵菌核病的田间小区实验防治效果Table 3 Effects of three Trichoderma strains on sunflower sclerotinia rot in field experiments

3 讨论

应用木霉防治植物土传病害已经成为目前生物防治研究的热点[18,19]。木霉的防病机制包括竞争、抗生、重寄生、诱导植物抗病性等，不同菌株存在多种不同的机制并可能共同发挥作用，达到防病的目的[20-22]。本研究筛选的3株木霉菌N862、N246、X102，对向日葵菌核病菌均具有较强的竞争能力，生长抑制率均超过85%，对向日葵菌核病的盆栽防效均超过70%，其中N862的防效超过85%，田间防效达到67%以上，高于文献报道的链霉菌、芽胞杆菌、木霉M1M2菌株等的防治效果[5-10]，有重要的开发应用价值。本研究中的3株木霉菌通过拌土结合灌根处理防治向日葵菌核病均能够获得较好的防病效果，但单独的拌土和灌根处理的防病效果差异较大，说明木霉N862、N246、X102的防病机制存在差异，并且N862和N246对病菌的抗生作用强于X102，需进一步研究。

生防菌防治向日葵菌核病的机制研究中，报道了多种生防菌产生的抑菌物质。如枯草芽胞杆菌S-16能产生对向日葵菌核病有拮抗作用的抑菌物质, 为一种热稳定的脂肽类物质，对菌核病的抑菌圈直径最大可达 1.72 cm[7]，蜡状芽胞杆菌 CF4-51产生 2种抑菌物质 1-Methyldodecylamine（十二烷基甲胺）和2-cyano-acetamide（氰基乙酰胺）可以抑制核盘菌菌核的形成[8]。但木霉菌防治向日葵菌核病的机制报道较少。孙冬梅等[23]报道了一株黄绿木霉代谢产物能够使向日葵菌核病菌的致病力降低97.9%。本研究通过离体叶片试验发现，3株木霉都能产生抑菌物质，其中N862和N246代谢产物的抑菌效果好于X102，它们所产生的抑菌物质有待进一步研究。

此外，多株拮抗菌的复合菌剂对向日葵菌核病的防治效果往往高于单一菌剂，如链霉菌和芽胞杆菌复合菌剂的防治效果可达到81%以上，高于单一菌剂的防效[5]。郑晓薇[24]将7株向日葵菌核病拮抗菌，包括微白黄链霉菌S. albidoflavus、肉桂色链霉菌S. cinnamonensis和贝莱斯芽胞杆菌B. velezensis等，按不同比例制备混合菌剂，对向日葵菌核病的盆栽防效最高达到83.08%。本研究仅开展了单一木霉处理的防病效果，下一步将开展利用不同木霉菌株和/或其他高效菌株的混合菌剂防治向日葵菌核病的研究，为提高防病效果，推动产品应用奠定基础。