多羧酸受体荧光探针的识别位点设计与机制研究*

成 昭，徐 玥，郑 蕾，何 昊

（西安医学院 药学院，陕西 西安 710021）

过渡金属Zn、Cu、Hg广泛分布于生命体，参与多种生理过程，同时，表现与氧化还原相关生理活动的较高活性。除作为多种酶、蛋白质的必要组成之外，Zn、Cu、Hg的动态分布与动态变化，还被证明与神经生理学、神经病理学研究紧密相关。现阶段已有多项研究显示，Zn、Cu的异常积累，可能引发生命体中不受控制的氧化还原反应，导致认知活跃度降低、行动障碍[1,2]，与阿尔茨海默氏病（AD，Alzheimer's Disease）、帕金森氏病（PD，Parkinson's Disease）等神经退行性疾病密切相关[3,4]。此外，空气、土壤、水体中过量分布的Cu和Hg，不仅影响生态环境，通过食物链富集、经食源性摄入后，还将危及人体健康[5]。因此，实现Zn2+、Cu2+和Hg2+的快速、有效检测，将具有广泛的应用和研究前景[6,7]。

本文基于能够实现目标物快速、直观可视检测的小分子荧光探针技术[8,9]，设计苯乙烯类发色团苯并咪唑作为荧光基团、苯胺类受体作为识别基团，定向构筑荧光探针的识别基团与识别位点，合成得到一系列结构相似的多羧酸受体荧光探针。分别以苯胺、2-氨基苯酚、3-氨基苯酚等作为起始原料，通过溴乙酸甲酯对羟基、氨基中氢的取代，分别在识别基团中引入了两个识别位点、邻位3个与间位3个识别位点，合成了识别位点有差异的3种荧光探针T1～T3（图1）。差异性设计识别位点数目与空间排布，从而调控探针与目标物结合能力，期望能够初步阐明探针-目标物识别过程的可能作用机制。

图1 S1，S2与S3的结构Fig.1 Structures of S1,S2 and S3

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

XT-4型显微熔点仪（北京泰克）；TENSOR T-27型傅里叶变换红外光谱仪（美国布鲁克）；AVANCE III 400MHz型超导核磁共振波谱仪（美国布鲁克）；microTOF-QⅡESI-Q-TOF LC/MS/MS型飞行时间-质联仪（美国布鲁克）；UV-1700型紫外分光光度计（日本岛津）；LS-55型荧光分光光度计（美国铂金埃尔默）。

苯胺、2-氨基苯酚、3-氨基苯酚、溴乙酸甲酯、三氯氧磷、邻苯二胺、无水K2CO3、还原铁粉，均为化学纯，国药集团化学试剂有限公司；N,N-二甲基甲酰胺（DMF）、甲醇、乙醇、乙腈、乙酸乙酯、石油醚，均为化学纯，天津市天力化学试剂有限公司。

1.2 实验方法

以苯胺、2-氨基苯酚、3-氨基苯酚、邻苯二胺、溴乙酸甲酯、二异丙基乙胺、三氯氧磷等为反应物，合成得到多羧酸受体荧光探针S1～S3，合成路线（以S1为例）见图2。

图2 S1的合成路线Fig.2 Synthetic route of S1

1.2.1 N,N-二乙酸甲酯基苯胺（化合物I）的合成将二异丙基乙胺（21.75mL，0.125mol）、溴乙酸甲酯（11.75mL，0.125mol）分 别 加 入 苯 胺（2.28mL，0.025mol）的25mL乙腈溶液中，80℃下反应12h。待反应结束、冷却，以冰水稀释后，进行反应混合物有机相的萃取（二氯甲烷，100mL×3次），干燥、真空旋干溶剂，柱分离，V乙酸乙酯∶V石油醚=1∶3为洗脱剂，得到N,N-二乙酸甲酯基-苯胺（化合物I）。

合成S2、S3的中间体1-O-2-N,N-三乙酸甲酯基-2-氨基苯酚、1-O-3-N,N-三乙酸甲酯基-3-氨基苯酚的合成方法 类似于化合物I，反应物投入量为2-氨基苯酚/3-氨基苯酚（1.09g，0.01mol），二异丙基乙胺（13.05mL，0.075mol），溴乙酸甲酯（7.05mL，0.075mol）。

N,N-二乙酸甲酯基苯胺（化合物I）淡黄色油状物，5.23g，产率88%。1H NMR（CDCl3,400MHz），δ：6.75（t,J=8.0Hz,2H,Ar-H），6.31（t,J=7.3Hz,1H,Ar-H），6.14（d,J=8.4Hz,2H,Ar-H），3.67（s,4H,2×-CH2-），3.28（s,6H,2×-CH3）。IR（KBr），ν，cm-1：3031.33（ν=C-H）；2952.76，2849.55（νC-H）；1742.01（νC=O）；1601.25，1504.75（νC=C）；1270.22（νC-O）；1204.01（νC-N）；752.82，693.38（δ=C-H）。ESI-MS，m/z：260.0891[M+Na]+。

1-O-2-N,N-三乙酸甲酯基-2-氨基苯酚 白色粉末，产率89%，m.p.65～66℃。1H NMR（CDCl3，400MHz），δ：6.92（d,J=3.9Hz,2H,Ar-H），6.81（d,J=7.7Hz,2H,Ar-H），4.67（s,2H,-CH2-），4.22（s,4H,2×-CH2-），3.79（s,3H,-CH3），3.73（s,6H,2×-CH3）。IR（KBr），ν，cm-1：2991.62，2953.79（νC-H）；1750.68（νC=O）；1590.23，1511.35（νC=C）；1202.91（νC-O）；750.34（δ=C-H）。ESI-MS，m/z：348.1055[M+Na]+。

1-O-3-N,N-三乙酸甲酯基-3-氨基苯酚 淡黄色油状物，产率90%。1H NMR（CDCl3,400MHz），δ：7.12（t,J=8.2Hz,1H,Ar-H），6.27（t,J=9.2Hz,2H,Ar-H），6.21（s,1H,Ar-H），4.58（s,2H,-CH2-），4.12（s,4H,2×-CH2-），3.79（s,3H,-CH3），3.74（s,6H,2×-CH3）。IR（KBr），ν，cm-1：3004.70（ν=C-H）；2954.02，2851.92（νC-H）；1744.41（νC=O）；1609.38，1502.83（νC=C）；1177.36（νC-O）；890.34，756.98，688.95（δ=C-H）。ESI-MS，m/z：348.1051[M+Na]+。

1.2.2 4-甲酰基-N,N-二乙酸甲酯基苯胺（化合物II）的合成 保持反应温度为5～10℃，将2.4mL三氯氧磷缓慢滴加至20mL DMF中，再将上述所得的POCl3/DMF混合物滴加至化合物I（2.37g，0.01mol）的20mL DMF溶液中，75℃下反应4h。待反应结束、冷却，以冰水稀释、抽滤，滤渣进行柱分离，V乙酸乙酯∶V石油醚=1∶1为洗脱剂，得到4-甲酰基-N,N-二乙酸甲酯基苯胺（化合物II）。

合成S2、S3的中间体4-甲酰基-N,N-二乙酸甲酯基苯胺、5-甲酰基-1-O-2-N,N-三乙酸甲酯基-2-氨基苯酚的合成方法 类似于化合物II，反应物投入量为1-O-2-N,N-三乙酸甲酯基-2-氨基苯酚/1-O-3-N,N-三乙酸甲酯基-3-氨基苯酚（3.25g，0.01mol）。

4-甲酰基-N,N-二乙酸甲酯基苯胺（化合物II） 淡黄色粉末，0.23g，产率85%，m.p.58～60℃。1H NMR（CDCl3,400MHz），δ：9.79（s,1H,-CHO），7.76（d,J=7.8Hz,2H,Ar-H），6.66（d,J=8.0Hz,2H,Ar-H），4.23（s,4H,2×-CH2-），3.79（s,6H,2×-CH3）。IR（KBr），ν，cm-1：2824.47，2743.11（ν-CHO）；1746.67（νC=O）；1599.54，1523.10（νC=C）；1207.48（νC-O）；814.96（δ=C-H）。ESI-MS，m/z：288.0847[M+Na]+。

5-甲酰基-1-O-2-N,N-三乙酸甲酯基-2-氨基苯酚 淡黄色粉末，产率82%，m.p.91～92℃。1H NMR（CDCl3,400MHz），δ：9.78（s,1H,-CHO），7.41（d,J=8.2Hz,1H,Ar-H），6.80（d,J=8.2Hz,2H,Ar-H），4.67（s,2H,-CH2-），4.29（s,4H,2×-CH2-），3.81（s,3H,-CH3），3.79（s,6H,2×-CH3）。IR（KBr），ν，cm-13078.89（ν=C-H）；1747.87，1681.41（νC=O）；1600.55，1519.89（νC=C）；1212.84，1168.57（νC-O）；869.87，801.79，760.94（δ=C-H）。ESI-MS，m/z：376.1000[M+Na]+。

6-甲酰基-1-O-3-N,N-三乙酸甲酯基-3-氨基苯酚 白色粉末，产率86%，m.p.103～104℃。1H NMR（CDCl3,400MHz），δ：10.31（s,1H,-CHO），7.77（d,J=8.8Hz,1H,Ar-H），6.28（d,J=8.8Hz,1H,Ar-H），5.92（d,J=2.0Hz,1H,Ar-H），4.71（s,2H,-CH2-），4.18（s,4H,2×-CH2-），3.83（s,3H,-CH3），3.79（s,6H,2×-CH3）。IR（KBr），ν，cm-1：2961.48，2855.48（νC-H）；1735.75（νC=O）；1602.36，1522.61（νC=C）；1205.76（νC-O）；812.40，735.56（δ=C-H）。ESI-MS，m/z：376.0998[M+Na]+。1.2.3探针S1～S3的合成 将化合物II（0.27g，1mmol）、邻苯二胺（0.11g，1mmol）溶于20mL乙醇中，80℃下反应6h。待反应结束、冷却、真空旋干溶剂，柱分离，V乙酸乙酯∶V石油醚=2∶1为洗脱剂，得到4-苯并咪唑基-N,N-二乙酸甲酯基苯胺（探针S1）。

5-苯并咪唑基-1-O-2-N,N-三乙酸甲酯基-2-氨基苯酚（探针S2）、6-苯并咪唑基-1-O-3-N,N-三乙酸甲酯基-3-氨基苯酚（探针S3），合成方法类似于探针S1，反应物投入量为5-甲酰基-1-O-2-N,N-三乙酸甲酯基-2-氨基苯酚/6-甲酰基-1-O-3-N,N-三乙酸甲酯基-3-氨基苯酚（0.35g，1mmol）。

4-苯并咪唑基-N,N-二乙酸甲酯基苯胺（探针S1） 白色粉末，0.25g，产率71%，m.p.202～204℃。1H NMR（CD3OD,400MHz），δ：7.86（d,J=8.6Hz,2H,Ar-H），7.48（dd,J=5.7,3.1Hz,2H,Ar-H），7.13（dd,J=5.8,3.0Hz,2H,Ar-H），6.61（d,J=8.7Hz,2H,Ar-H），4.13（s,4H,2×-CH2-），3.70（s,6H,2×-CH3），3.27（s,1H,-NH-）。IR（KBr），ν，cm-1：3599.68（νN-H）；1740.71（νC=O）；1614.33，1504.57，1446.39（νC=C）；1207.37（νC-O）；836.18（δ=C-H）。ESI-MS，m/z：354.1445[M+H]+。

5-苯并咪唑基-1-O-2-N,N-三乙酸甲酯基-2-氨基苯酚（探针S2）红色油状物，产率72%。1H NMR（CD3OD,400MHz），δ：7.61～7.53（m,4H,Ar-H），7.21（s,2H,Ar-H），6.88（d,1H,J=8.0Hz,Ar-H），4.87（s,2H,-CH2-），4.25（s,4H,2×-CH2-），3.78（s,3H,-CH3），3.73（s,6H,2×-CH3），3.29（s,1H,-NH-）。IR（KBr），ν，cm-1：3445.35（νN-H）；1745.70（νC=O）；1611.25，1509.17（νC=C)；1200.25（νC-O）；881.69，811.55（δ=C-H）。ESI-MS，m/z：442.1605[M+H]+。

6-苯并咪唑基-1-O-3-N,N-三乙酸甲酯基-3-氨基苯酚（探针S3）黄色粉末，产率71%，m.p.173～174℃。1H NMR（CD3OD,400MHz），δ：7.88（s,2H,Ar-H），7.51（d,J=8.8Hz,2H,Ar-H），7.23（t,J=7.6Hz,2H,Ar-H），6.36（d,J=8.6Hz,1H,Ar-H），4.82（s,1H,-NH-），4.22（s,2H,-CH2-），3.68（s,4H,2×-CH2-），3.22（s,3H,-CH3），2.76（s,6H,2×-CH3）。IR（KBr），ν，cm-1：3333.04（νN-H）；1741.61（νHC=O）；1666.41，1615.33（νOC=O）；1571.80，1497.46，1443.78（νC=C）；1208.96（νC-O）；852.76，813.78（δ=C-H）。ESI-MS，m/z：442.1606[M+H]+。

1.2.4 探针T1～T3的合成

直接合成得到的荧光探针S1～S3，其多羧酸受体部分为乙酸甲酯，由于酯水溶性有限，致使S1～S3在水系离子识别实验中应用受限，需将乙酸甲酯形探针S1～S3水解为其羧酸盐形式T1～T3。

将S1（0.0353g，0.1mmol）、CsOH·H2O（0.1679g，1mmol）溶解于10mL乙醇中，回流反应12h。待反应结束、冷却、真空旋干溶剂，得到探针T1。T2/T3的合成方法类似，反应物用量为S2/S3（0.0441g，0.1mmol）。

1.3 结构表征

由探针S1～S3的1H NMR、IR与MS等表征数据可知，探针结构正确，符合实验预期设计，可以进行进一步的光学性质研究。

2 结果与讨论

2.1 探针的荧光激发与发射光谱

进行200～500nm波段探针S1～S3的光谱扫描，得到其最大荧光激发与发射波长为S1：λex,max=325nm，λem,max=380nm；S2：λex,max=329nm，λem,max=390nm；S3：λex,max=333nm，λem,max=379nm，斯托克位移分别为55、61、46nm。相较于探针S1结构，S2/S3受体部分中，邻位/间位羟基的引入与羟基氢的后续修饰，致使S2/S3吸收、发射谱峰均表现红移。取代基改变与探针分子的荧光光谱调控，对于未来工作中进行荧光探针结构设计、具有一定的指导意义。

2.2 探针对金属离子的选择性

设计以一价碱金属（Na+）、二价碱土金属（Mg2+、Ca2+、Ba2+），以及过渡金属（Fe3+、Cu2+、Zn2+、Cd2+、Cr3+、Hg2+、Ag+）及Sn2+、Al3+等14种常见金属离子，考察T1～T3的金属离子选择性。向1号比色管中仅加入探针，向2～14号比色管中，分别加入Tris-HCl、探针与各金属离子（图3d，横坐标1-14：T2、Ag+、Al3+、Ba2+、Ca2+、Cr3+、Cu2+、Fe3+、Hg2+、Mg2+、Na+、Sn2+、Zn2+），使探针与金属离子的终浓度均为1.0×10-5mol·L-1，进行350～550nm波段光谱扫描，得到图3。

由图3可知，图3（a）各荧光谱线均重合在一起，说明T1对金属离子均无响应；探针T2对Zn2+、Cu2+/Hg2+呈现选择性增强、减弱响应，其它金属离子则未引起探针T2荧光强度的明显变化；上述各金属离子与T3混合时，T3荧光信号呈现整体猝灭趋势。综合离子选择实验结果，可知探针T1、T2、T3识别基团中两个识别位点、邻位3个识别位点与间位3个识别位点的结构差异，影响了识别位点所形成的离子包合空腔尺寸，表现为离子选择性的显著差别。T2的N、N、O所连接的3个乙酸根柔性链能够形成合适的包合空腔，实现对Zn2+/Cu2+/Hg2+离子的选择性识别，结合探针分子的电子效应变化，将能够进一步分析和解释T2进行离子识别的作用机制。

图3 探针（a）T1、（b）T3与（c）、（d）T2的离子选择性Fig.3 Selectivity of probes（a）T1,（b）T3 and（c），（d）T2 towards various metal ions

2.3 Zn2+/Cu2+对探针T2的荧光滴定曲线

将浓度依次递增的Zn2+/Cu2+溶液分别加入探针T2中，使T2终浓度为1.0×10-5mol·L-1、Zn2+/Cu2+终浓度为0～1000μmol·L-1，进行350～550nm波段T2-Zn2+与T2-Cu2+的光谱扫描，结果见图4。

图4 （a）T2-Zn2+与（b）T2-Cu2+的荧光滴定曲线Fig.4 Fluorescence titration curves of（a）T2-Zn2+and（b）T2-Cu2+

由图4可知，Zn2+/Cu2+浓度递增时，T2荧光强度随Zn2+浓度升高而增强，随Cu2+浓度升高而减小。对T2荧光强度F（T2-Zn2+/Cu2+在390nm处的荧光强度峰值）与Zn2+/Cu2+浓度进行相关性分析[11]，得到荧光强度F（y）与[Zn2+]/[Cu2+]（x）的线性方程，分别为T2-Zn2+（0～40μmol·L-1）：y＝40.443x+1011.9（R2=0.9958），T2-Cu2+（0～40μmol·L-1）：y＝-60.67x+3659.3（R2=0.9928）。当Zn2+/Cu2+浓度处于0～40μmol·L-1范围时，探针荧光强度与[Zn2+]/[Cu2+]均呈现准确的定量关系，初步满足浓度数量级为μmol·L-1的生理Zn2+/Cu2+检测。

2.4 探针T2与Zn2+/Cu2+的络合比

进行10mL比色管编号，保持1#～11#管中T2与Zn2+的总浓度为1.0×10-5mol·L-1，使Zn2+摩尔分数依次递增，分别为0、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%，进行荧光强度与相应离子摩尔分数的分析，得到图5（a）所示的Job's曲线。

图5 （a）T2-Zn2+与（b）T2-Cu2+的络合比Fig.5 Complexation stoichiometry of（a）T2-Zn2+and（b）T2-Cu2+

图5（a）T2-Zn2+体系荧光强度最高点所对应的Zn2+摩尔分数为0.5，即代表了T2与Zn2+的最优结合比例，说明探针T2与Zn2+的定量结合比例是1∶1。

对比图5（b）T2-Cu2+荧光猝灭型响应，当Cu2+与T2浓度达到一致、两者1∶1结合时，图5（b）出现拐点。此后，T2荧光几乎完全猝灭，T2荧光不再随Cu2+加入而改变。说明T2与Cu2+的络合比为1∶1。

2.5 探针识别机制

探针T2对Zn2+、Cu2+/Hg2+表现差别性荧光响应，可能主要基于以下因素：（1）ICT（intramolecular charge transfer，分子内电荷转移）识别机制[12,13]，T2分子内氮原子的孤对电子作为电子给体，不饱和环作为电子受体，构成了探针T2的ICT路径，使其呈现荧光。当T2通过弱配位作用识别Zn2+/Cu2+/Hg2+时，T2的氮原子与羧基氧原子则需提供其孤对电子，与Zn2+/Cu2+/Hg2+的空轨道形成配位键，供电子能力被大幅削弱，T2的ICT过程也被完全阻断或大幅削弱，T2-Cu2+/Hg2+体系因此荧光强度降低、甚至猝灭，出现T2对Cu2+/Hg2+的猝灭型荧光响应。（2）过渡金属离子通过自旋-轨道耦合、电子或能量转移使荧光基团荧光猝灭[14]，可导致荧光猝灭型响应。但由Irving-Williams规则可知，Zn2+配位稳定性明显弱于Cu2+、Hg2+，且极化能力与变形性较弱、空轨道较少、还原性远大于Cu和Hg，导致Zn2+作为电子受体的能力较弱、较难接受孤对电子配位，致使探针-Zn2+呈现与探针-Cu2+/Hg2+相反的识别方式。

离子识别实验显示，T1对金属离子均无响应；T3荧光信号因金属离子的加入呈现整体猝灭趋势，对金属离子亦无响应；而探针T2分别对Zn2+表现特异性荧光增强，对Cu2+/Hg2+表现荧光猝灭型响应。T1～T3在识别性能上的差异性与其识别位点设计具有直接关系，其识别基团结合Zn2+/Cu2+/Hg2+的可能识别机制见图6。

图6 探针T1～T3的识别位点与识别性能差异Fig.6 Differences in recognition sites and recognition properties of probes T1～T3

由图6可知，T1～T3以包合空腔[15,16]结合Zn2+/Cu2+/Hg2+，T1的两条羧酸柔性链仅构成两个识别位点，无法有效包合Zn2+/Cu2+/Hg2+。T3分子中处于间位的3条柔性羧酸链，形成的包合空隙过大，无法稳定包合，受到电子或能量转移等因素影响时，使其表现整体荧光猝灭、无识别响应[14]。而邻位三位点的探针T2，邻位3条羧酸链形成了尺寸合适的包合空腔，能够容纳Zn2+/Cu2+/Hg2+，且受到Zn2+/Cu2+/Hg2+电子效应、配位能力差异性的影响，进一步对Zn2+、Cu2+/Hg2+表现荧光增强、荧光猝灭的差别性响应。

3 结论

经识别位点的差别性设计，构筑得到二位点探针T1、邻位三位点探针T2与间位三位点探针T3，因T2结构中处于邻位的3条羧酸柔性链所形成的包合空腔，T2与Zn2+、Cu2+、Hg2+表现特征响应与定量结合，能够初步满足浓度数量级为μmol·L-1的生理Zn2+、Cu2+、Hg2+检测。结合荧光、紫外等光谱学手段与识别位点的差别性设计，初步阐明了探针T2对Zn2+、Cu2+/Hg2+的识别机制差异，为探针结构优化与识别性能筛选等研究工作提供了参考。