子宫内膜癌患者血清诱导型一氧化氮合酶、可溶性肿瘤坏死因子受体水平及临床意义

买卫红，吴宁，张晓慧

周口市人民医院妇产科，河南 周口 466000

子宫内膜癌（endometrial cancer，EC）是常见的生殖系统恶性肿瘤之一，最常见的病理类型为内膜样腺癌，约70%以上发生于绝经老年女性，近年来EC发病趋于年轻化[1-2]。目前EC的诊断无特异性肿瘤标志物，越来越多的学者致力于探索对EC诊断及严重程度预判等价值较高的血清学指标，以期及早诊断疾病并及时予以相应治疗，进而改善患者预后。一氧化氮是人体内重要的细胞间信号传递因子，具有诱导肿瘤细胞凋亡的作用，其由一氧化氮合酶（nitricoxide synthase，NOS）催化合成[3]。其中，诱导型一氧化氮合酶（inducible NOS，iNOS）在正常组织中很少表达，在肿瘤组织或参与病理过程的炎性细胞中表达，已有研究表明其与淋巴瘤、肺癌、肝癌等发生发展密切相关[4-6]。可溶性肿瘤坏死因子受体（soluble tumor necrosis factor receptor，sTNFR）分为sTNF-RⅠ、sTNF-RⅡ两种，分别来源于肿瘤坏死因子受体p55和p75的膜外段[7]。sTNFR与肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）结合后阻断了TNF与膜受体的结合，进而抑制TNF功能，保护机体抵抗TNF的病理损伤，已有研究发现sTNFR水平变化在喉癌、宫颈癌等临床诊疗中具有重要意义[8-9]。然而，针对iNOS及sTNFR与EC发生发展的相关研究较为少见。本研究探讨EC患者血清iNOS、sTNFR的水平及临床意义，现报道如下。

1 对象与方法

1.1 研究对象

选取2017年1月至2020年1月周口市人民医院收治的55例首诊为EC的患者作为EC组。纳入标准：①符合《2015年NCCN子宫内膜癌临床实践指南解读》[10]中EC诊断标准；②病理检查结果为EC；③初诊EC；④术前未行放化疗、生物免疫治疗等抗肿瘤治疗。排除标准：①有其他部位肿瘤未治愈；②有严重的心脑肝肾或其他疾病；③合并自身免疫性疾病。55例EC患者，年龄24～65岁，平均（48.66±10.32）岁；子宫内膜样腺癌51例，其他4例；淋巴结转移10例；Ⅰ～Ⅱ期26例，Ⅲ～Ⅳ期29例。选取55例同期子宫良性病变患者作为子宫良性病变组。纳入标准：①因子宫肌瘤等良性病变行子宫全切术；②病理检查结果为良性；③术前未接受生物免疫疗法。排除标准：①有其他部位肿瘤未治愈；②有严重的心脑肝肾或其他疾病；③合并自身免疫性疾病。55例子宫良性病变患者，年龄31～64岁，平均（49.31±11.46）岁；子宫肌瘤33例，子宫内膜息肉12例，子宫肥大症6例，子宫腺肌病4例。另选取55例同期同年龄段健康体检的女性作为健康组，年龄 29～65岁，平均（49.14±10.58）岁。EC组、子宫良性病变组及健康组研究对象的年龄比较，差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。本研究经医院伦理委员会批准通过，所有患者均知情同意并签署知情同意书。

1.2 检测方法

取3组研究对象晨起空腹静脉血3 ml，离心（3000 r/min，10 min，离心半径12 cm）分离出血清后置于-20℃冰箱中保存待检。

iNOS检测[11]：采取双抗体酶联免疫吸附法，采用抗人iNOS抗体包被微孔板，制成固相抗体，包被单抗的微孔中依次加入iNOS，再与辣根过氧化物酶（horse radish peroxidase，HRP）标记的iNOS抗体相结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，加入酶底物四甲基联苯胺（tetramethylbenzidine，TMB），出现黄色时加入硫酸终止，用酶标仪在450 nm波长下测定吸光度（optical density，OD）值，以空白孔调零，450 nm波长依序测量各孔OD值，通过标准曲线计算样品中iNOS浓度。

sTNFR检测[12]：包括sTNF-R Ⅰ、sTNF-R Ⅱ，采取双抗体夹心酶联免疫吸附法，采用抗人sTNF-R Ⅰ、sTNF-R Ⅱ单抗包被于酶标板上，标准品与样品中的sTNF-R Ⅰ、sTNF-R Ⅱ和单抗结合，加入生物素化的sTNF-R Ⅰ、sTNF-R Ⅱ抗体，形成免疫复合物，HRP标记的链霉抗生素蛋白与生物素相结合，加入酶底物邻苯二胺（o-phenylenediamine，OPD），出现黄色时加入硫酸终止，在492 nm处测得OD值，sTNF-R Ⅰ、sTNF-R Ⅱ值与OD值呈正比，通过绘制标准曲线计算标本中的sTNF-R Ⅰ、sTNF-R Ⅱ浓度。

1.3 观察指标

比较EC组、子宫良性病变组及健康组研究对象血清iNOS及sTNF-R Ⅰ、sTNF-R Ⅱ水平，比较Ⅰ～Ⅱ期与Ⅲ～Ⅳ期EC患者血清iNOS及sTNF-R Ⅰ、sTNF-R Ⅱ水平。对手术切除的子宫内膜标本进行免疫组化检测，分析EC患者血清iNOS及sTNFR异常表达与临床特征的关系及影响因素。以iNOS≥1.23 U/ml、sTNF-R Ⅰ≥1.18 ng/ml、sTNF-R Ⅱ≥3.93 ng/ml为高表达[13]。

1.4 统计学方法

采用SPSS 20.0软件进行统计学分析。计量资料以均数±标准差（±s）表示，两组比较采用t检验，多组比较采用单因素方差分析；计数资料以例数及率（%）表示，组间比较采用χ2检验或Fisher确切概率法；影响因素分析采用多因素Logistic回归分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 血清iNOS及sTNFR水平的比较

EC组患者血清iNOS、sTNF-R Ⅰ、sTNF-R Ⅱ水平均高于子宫良性病变组及健康组，差异均有统计学意义（P＜0.05）；子宫良性病变组与健康组血清iNOS、sTNF-R Ⅰ、sTNF-R Ⅱ水平比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。（表1）

表1 EC组、子宫良性病变组及健康组研究对象血清iNOS及sTNFR水平的比较（±s）

表1 EC组、子宫良性病变组及健康组研究对象血清iNOS及sTNFR水平的比较（±s）

注：a与健康组比较，P＜0.05；b与子宫良性病变组比较，P＜0.05

组别EC组（n=55）子宫良性病变组（n=55）健康组（n=55）F值P值1.33±0.38a b 0.86±0.25 0.81±0.21 54.102 0.000 1.54±0.41a b 0.84±0.26 0.78±0.20 106.848 0.000 4.36±0.71a b 2.79±0.64 2.71±0.61 111.082 0.000 iNOS（U/ml）sTNFR（ng/ml）sTNF-RⅠsTNF-RⅡ

2.2 不同病理分期EC患者血清iNOS及sTNFR水平的比较

Ⅰ～Ⅱ期EC患者血清iNOS、sTNF-R Ⅰ、sTNF-R Ⅱ水平均低于Ⅲ～Ⅳ期患者，差异均有统计学意义（P＜0.05）。（表2）

表2 不同病理分期EC患者血清iNOS及sTNFR水平的比较（±s）

表2 不同病理分期EC患者血清iNOS及sTNFR水平的比较（±s）

病理分期Ⅰ～Ⅱ（n=26）Ⅲ～Ⅳ（n=29）t值P值1.12±0.29 1.52±0.43 3.996 0.000 1.40±0.36 1.67±0.52 2.213 0.031 4.12±0.66 4.58±0.74 2.421 0.019 iNOS（U/ml）sTNFR（ng/ml）sTNF-RⅠsTNF-RⅡ

2.3 不同临床特征EC患者血清iNOS及sTNFR高表达情况的比较

不同病理分期、分化程度及子宫肌层浸润深度EC患者iNOS、sTNF-R Ⅰ、sTNF-R Ⅱ高表达情况比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）；不同年龄、病理类型及淋巴结转移情况EC患者iNOS、sTNF-R Ⅰ、sTNF-R Ⅱ高表达情况比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。（表3）

表3 不同临床特征EC患者血清iNOS及sTNFR高表达情况的比较（n=55）

2.4 EC患者血清iNOS及sTNFR高表达影响因素的多因素分析

病理分期为Ⅲ～Ⅳ期、低分化、子宫肌层浸润深度＞1/2均为EC患者血清iNOS、sTNF-R Ⅰ、sTNF-R Ⅱ高表达的独立危险因素（P＜0.05）。（表4）

表4 EC患者血清iNOS及sTNFR高表达影响因素的多因素分析

3 讨论

EC是危害女性生命安全的常见恶性肿瘤之一，主要发生于子宫内膜腺体，以腺癌最常见[14]。EC好发于绝经老年女性，恶性程度较高，由于早期症状不足以引起重视，大多数患者就诊时已至中晚期，预后相对较差[15]。因此，将EC早期筛查与诊断、有助于治疗方案制订的分子标志物寻找出来，并探索其中的关系具有重要的临床价值。

本研究发现，EC组患者血清iNOS、sTNF-R Ⅰ、sTNF-R Ⅱ水平均高于子宫良性病变组及健康组，子宫良性病变组患者血清iNOS、sTNF-R Ⅰ、sTNFR Ⅱ水平与健康组无明显差异，这一结果与姜腊元和谢晖[16]、陆林和陆志刚[17]研究结果具有一定相似性，提示iNOS与sTNFR在EC的发生中起到一定促进作用。国外也早有研究报道与本研究结果相似，Li等[18]证实iNOS与EC的发生发展密切相关，Gadducci等[19]发现sTNFR在EC患者血清中水平显著升高。iNOS主要存在于白细胞等炎性细胞的细胞质中，正常情况下不表达，在病理条件下大量表达，而iNOS催化产生的高浓度NO则参与肿瘤的形成[20]。机体内NO的半衰期较短，因此可通过检测iNOS水平间接反映NO的生成情况。另一方面，正常人体内的TNF和sTNFR处于平衡状态，低浓度sTNFR具有运载TNF的作用，协助抑制肿瘤细胞增殖和破坏细胞，高浓度sTNFR则与TNF结合后阻止TNF与TNFR的结合，进而抑制TNF的多种生理功能。当EC发生后，肿瘤组织刺激机体产生TNF以阻止肿瘤的发展，与此同时肿瘤本身也在刺激作用下产生膜TNFR，其中部分脱落至细胞间质，形成了可溶形式，即sTNFR，与TNFR竞争性结合TNF，降低TNF的抗肿瘤作用，进而发挥肿瘤免疫逃逸的作用[21]。本研究中Ⅰ～Ⅱ期EC患者血清iNOS、sTNF-R Ⅰ、sTNF-R Ⅱ水平均低于Ⅲ～Ⅳ期患者，这一结果提示iNOS、sTNF-R Ⅰ、sTNF-R Ⅱ水平与病理分期有一定联系，各指标水平越高，肿瘤恶性程度越高。

本研究表明，不同病理分期、分化程度及子宫肌层浸润深度EC患者iNOS、sTNF-R Ⅰ、sTNF-R Ⅱ高表达情况比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）；不同年龄、病理类型及淋巴结转移情况EC患者iNOS、sTNF-R Ⅰ、sTNF-R Ⅱ高表达情况比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。病理分期为Ⅲ～Ⅳ期、低分化、子宫肌层浸润深度＞1/2均为EC患者血清iNOS、sTNF-R Ⅰ、sTNF-R Ⅱ高表达的独立危险因素（P＜0.05）。这说明iNOS、sTNFR的高表达与EC严重程度密切相关，提示肿瘤恶性程度较高，也意味着预后可能相对不佳。这对EC的治疗也有一定的提示意义，iNOS、sTNF-R Ⅰ、sTNF-R Ⅱ高表达表明肿瘤恶性程度高，术后需进一步行放化疗，反之肿瘤恶性程度低，考虑术后辅助内分泌治疗即可[22]。淋巴结转移也是评判EC严重程度的指标之一，本研究中iNOS、sTNF-R Ⅰ、sTNF-R Ⅱ的高表达与是否存在淋巴结转移无明显关系，这一结果可能受研究纳入病例数较少等因素影响而存在偏倚。

综上所述，EC患者血清中iNOS、sTNF-R Ⅰ、sTNF-R Ⅱ水平均升高，且晚期患者iNOS、sTNF-R Ⅰ、sTNF-R Ⅱ水平均高于早期患者，各指标高表达与病理分期、分化程度、子宫肌层浸润深度密切相关，这提示iNOS与sTNFR等分子的检测对早期诊断EC、制订合理的治疗方案、判断疾病严重程度及预后具有重要的临床意义，未来还需更多的临床研究和数据加以探索证实。