基于网络药理学研究六味地黄丸治疗腰椎间盘退变作用机制

冯帅华，徐无忌，仇湘中，吴官保，张信成，谢 芳，廖建晖

(1.湖南省中医药研究院附属医院，湖南 长沙 410006；2.湖南中医药大学第二附属医院，湖南 长沙 410005)

腰椎间盘退变(Lumbar disc degeneration，LDD)是临床导致下腰痛常见的原因之一，其以髓核细胞增殖活性及数量减少、细胞外基质的合成与分解失衡为病理特点[1]。根据《全球疾病负担》报告，下腰痛是导致残疾的主要原因之一，占总致残率的10.7%[2]。六味地黄丸是滋阴补肾的经典名方，对肾阴虚型LDD有突出疗效[3]。目前，六味地黄丸干预LDD的具体作用机制尚不明确，本研究利用网络药理学方法，挖掘六味地黄丸治疗LDD的作用机制。

1 资料与方法

1.1 资料来源 中药系统药理学数据库与分析平台(Traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform,TCMSP)、Gene Cards数据库、OMIM数据库、Uniprot数据库。

1.2 研究方法

1.2.1 六味地黄丸有效成分及作用靶点筛选：应用TCMSP数据库检索六味地黄丸中熟地黄、山茱萸、牡丹皮、山药、泽泻、茯苓的有效成分。以口服生物利用度(Oral bioavailability，OB)>30%、类药性(Drug likeness，DL)>0.18为检索条件对检索结果进行筛选，得到六味地黄丸的有效成分。通过TCMSP数据库检索六味地黄丸有效成分的全部靶点，通过Perl插件筛选出六味地黄丸有效成分的作用靶点。

1.2.2 LDD疾病靶点筛选：本研究设置检索词为“Lumbar disc degeneration”，检索Gene Cards数据库及OMIM数据库，以相关性分数≥7为限制条件对检索结果进行筛选，并应用Uniprot数据库对疾病靶点进行标准化。

1.2.3 共同靶点筛选及PPI网络构建：应用相关软件筛选出六味地黄丸中药物有效成分与LDD的共同作用靶点。在String数据库中输入共同作用靶点，物种设置为人类蛋白，以0.7为最低互动分数，通过数据库建立蛋白互作网络(Protein protein interaction，PPI)。通过R软件统计分析获得共同靶点在PPI网络中出现的频次，并依次排序。

1.2.4 构建六味地黄丸-LDD调控网络图：应用Cytoscape 3.7.1软件构建六味地黄丸-LDD调控网络图。网络图中每一个节点代表有效成分或靶点，每一条连线代表节点之间的相互关系。

1.2.5 GO和KEGG通路富集分析：在Bioconductor数据库中下载相关数据，应用R软件对药物与疾病共同作用靶点进行GO富集分析和KEGG富集分析，应用Perl插件对部分结果进行转化。

2 结 果

2.1 六味地黄丸有效成分与作用靶点 根据设定的检索条件，得到六味地黄丸的有效成分。从结果来看，熟地黄有效成分2种，山药有效成分16种，山茱萸有效成分20种，茯苓有效成分15种，泽泻有效成分10种，丹皮有效成分11种，删除重复部分后得到六味地黄丸药物有效成分69种，药物作用靶点102个。根据药物-疾病调控网络筛选出对LDD疾病靶点相关的有效成分18种，见表1。

表1 六味地黄丸干预LDD的药物有效成分

2.2 LDD疾病靶点筛选 以“Lumbar disc degeneration”为关键词，相关性分数≥7为筛选条件，通过检索Gene Cards、OMIM数据库得到LDD疾病靶点990个。

2.3 药物有效成分、疾病共同靶点筛选及PPI网络图构建 应用R软件筛选得到990个LDD疾病靶点与102个药物有效成分作用靶点的30个共同靶点，分别为PTGS1、PLAU、BCL2、CASP9、CASP3、CASP8、PON1、ESR1、ADH1B、RELA、VEGFA、HIF1A、MTOR、MAPK8、ICAM1、VCAM1、EGFR、CCND1、FOS、IL-6、CAV1、MYC、BIRC5、NFE2L2、PARP1、COL3A1、HSF1、CRP、RUNX2、CTSD。在String数据库输入30个共同靶点，按互动分数>0.7构建PPI网络图(图1)。应用R软件统计各靶点在PPI网络中的出现频次，频次较高的MAPK8出现18次；ESR1、IL-6、VEGFA均为14次。

图1 六味地黄丸与LDD共同靶点PPI网络图

2.4 六味地黄丸-LDD调控网络图 采用Cytoscape 3.7.1软件构建六味地黄丸-LDD调控网络图，其中黄色节点为六味地黄丸，蓝色节点为药物有效成分，红色节点为LDD，绿色节点为共同作用靶点，见图2。

图2 六味地黄丸-LDD调控网络图

2.5 GO功能分析与KEGG通路富集分析 对共同作用靶点进行GO功能分析显示，共有35种不同细胞生物活动，排名前20的分子功能条目，见图3。主要与DNA结合转录激活物活性、RNA聚合酶Ⅱ特异性、组蛋白脱乙酰基酶结合、细胞凋亡过程的半胱氨酸型内肽酶活性等生物过程相关。对共同作用靶点进行KEGG通路富集分析显示，共有105个生物途径，排名前20的通路，见图4。主要与卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染、结直肠癌、糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、细胞凋亡等相关。

图3 共同靶点GO功能分析

图4 共同靶点KEGG富集分析

3 讨 论

LDD是盘源性腰痛、腰椎间盘突出症、腰椎管狭窄症等下腰痛疾患发生的主要病理基础[4]。LDD在中医理论中属于“腰痹病”范畴，素体禀赋不足，肾精亏损，风寒湿邪侵袭，气血运行不畅，血瘀脉阻，不通则痛，故其病机为本虚标实[5-6]。六味地黄丸出自钱乙《小儿药证直决》，由熟地黄、山茱萸、山药、泽泻、牡丹皮、茯苓6味中药组成。方中熟地黄、山茱萸、山药滋补肾、肝、脾三脏之阴，是为“三补”，其中熟地黄甘阴补肾，且为君药，用量较大，故以补肾为主。泽泻、牡丹皮、茯苓为“三泄”，共为佐药，使滋补而不留邪。六药合用，三补三泄是补肾阴之基本方，擅于治疗肾阴虚型腰腿疼痛[7]。现代研究表明，六味地黄丸能有效促进椎间盘细胞外基质中蛋白多糖、软骨素及Ⅱ型胶原蛋白表达，抑制p38MAPK和JNK信号通路的激活，降低髓核细胞凋亡，从而延缓腰椎间盘退变[8-10]。但上述实验研究均在动物体内或体外模型中完成，目前仍缺乏六味地黄丸干预人腰椎间盘退变的基础实验证据。

本研究以人类LDD疾病靶点为研究对象，在PPI网络中处于核心位置的主要是MAPK8、ESR1、IL-6、VEGFA等分子，这提示六味地黄丸可能主要通过以上靶点干预LDD。MAPK8是MAPKs家族的重要成员之一，MAPK8是JNK信号通路中的关键因子，对细胞凋亡、自噬、坏死、炎症反应等有显著调控作用，在多种疾病中存在异常表达[11]。ESR1是雌激素受体的亚型之一，在经典的雌激素信号通路中，雌激素直接与细胞核内的ESR1结合，激活下游靶基因表达，并且能促进细胞自噬，抑制细胞凋亡，促进软骨细胞增殖[12]。IL-6是白介素分子家族的重要成员，目前大量的研究表明，IL-6与细胞的炎症反应密切相关，能促进髓核细胞凋亡和坏死，抑制Ⅱ型胶原合成，在腰椎间盘退变过程中发挥重要的促进作用，也是导致炎性疼痛的主要原因之一[13]。VEGFA是血管内皮生长因子家族成员，是促进肿瘤血管形成的重要细胞因子，通过PI3K/AKT及NF-κB信号通路参与细胞炎症反应[14]。综上，六味地黄丸对LDD的干预作用是多方面的，这可能与中药多途径、多靶点干预疾病的特点有关。

六味地黄丸-LDD网络调控图体现了中药多途径、多靶点干预疾病的特点，图中有18种六味地黄丸的药物有效成分，30个疾病调控靶点。调控靶点较多的药物有效成分主要是槲皮素、豆甾醇，两者均具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤等作用[15-16]。研究表明，槲皮素通过抑制NF-κB信号通路活化，降低TNF-α、IL-6、IL-1β等炎症因子表达[17-18]。研究发现，豆甾醇对动物手术切口疼痛、坐骨神经痛、内脏疼痛等均表现出较好的镇痛效果[19]。以上从侧面反映了六味地黄丸对LDD导致的炎症反应和疼痛的治疗效果。综上，MAPK8、ESR1、IL-6、VEGFA应是开展LDD相关病理生理研究的良好切入点，但作者查阅文献发现，LDD涉及MAPK8、ESR1、VEGFA、槲皮素、豆甾醇的研究寥寥无几，这或许是本研究对LDD相关研究方向的提示。

KEGG分析结果显示，六味地黄丸治疗LDD主要涉及细胞凋亡、TNF、HIF-1等信号通路。髓核细胞的过度凋亡是LDD发生的主要病理基础之一，抑制髓核细胞凋亡能有效的延缓椎间盘退变[20]。周文明等[21]研究表明，补肾壮督方含药血清通过抑制髓核细胞线粒体凋亡通路的激活延缓椎间盘退变。六味地黄丸对髓核细胞的调控作用是否有异曲同工之妙还需要进一步的实验证实。TNF信号通路是细胞凋亡通路的上游通路之一，与细胞的炎症反应和凋亡关系密切。TNF信号通路的相关下游分子大多参与了细胞的炎症反应，并且能调控下游MAPK、NF-κB等炎性信号通路活化[22]。这提示六味地黄丸干预LDD与抑制椎间盘退变过程中的炎症反应密切相关。低氧为椎间盘内的正常生理环境，应力刺激与生化环境的相互干预加速了椎间盘的退变。HIF-1信号通路是细胞在低氧刺激下做出应激反应的主要信号通路。研究发现，HIF-1的表达与MAPK、NF-κB信号通路相关，并能影响其下游因子VEGF的表达[23-24]。这提示在生物应力刺激下的椎间盘内细胞炎症反应可能与HIF-1信号通路有关，而六味地黄丸可能通过干预此过程延缓腰椎间盘退变。

综上所述，本研究以六味地黄丸中药物有效成分和LDD疾病靶点为研究对象，利用网络药理学方法对药物与疾病的共同靶点进行相应分析，预测六味地黄丸可能通过MAPK8、ESR1、IL-6、VEGFA等靶点干预腰椎间盘退变，涉及组蛋白去乙酰化、细胞凋亡、细胞基因转录、整合素结合等分子功能，作用机制可能与细胞凋亡、TNF、HIF-1等信号通路相关，为六味地黄丸干预LDD的机制研究提供新方向。