通脉舒络胶囊对缺血性中风大鼠Th17细胞介导炎症反应的影响

王 逍，屈阳柳，胡雪纯，程 颖，李 雨，贾 妮

(1.陕西中医药大学附属医院，陕西 咸阳 712021；2.商洛市中医医院，陕西 商洛 726000；3.陕西中医药大学，陕西 咸阳 712046)

中风是导致全世界60岁以上老年人死亡的第二大原因，是致残的第一大原因[1]。中风分为缺血性和出血性两类，出血性中风是由脑内血管破裂引起[2]，而脑血管堵塞导致血流障碍引起缺血性中风，占中风病例的85%以上[3]，具有高致残率、高病死率的特点。研究表明，免疫反应诱导的缺血损伤后炎症是缺血性中风进展过程中必不可少的一步，缺血损伤后24 h内，激活了适应性免疫系统中的辅助T细胞17(T helper cell 17，Th17)细胞介导的体液和炎症效应[4]。Th17细胞与其刺激释放的其他促炎介质一起造成了血脑屏障(BBB)破坏，故单核细胞、中性粒细胞、T细胞等全身炎症细胞会透过BBB持续进入受损区域，加剧脑损伤[5]。

国医大师张学文根据缺血性中风的发病机制及长期临床实践提出气虚血瘀证是缺血性中风的常见证型[6]，其课题组经过多年的研究和探索制订了益气养血、活血化瘀、通脉舒络的治则，并在此基础上，拟定了通脉舒络方，由该方制成的通脉舒络胶囊对治疗气虚血瘀所致缺血性中风取得了良好的治疗效果。故本实验拟通过研究通脉舒络胶囊对缺血性中风大鼠Th17细胞介导的免疫炎症反应的影响，探讨通脉舒络胶囊是否通过影响神经局部及外周免疫中Th17细胞亚群功能的失衡状态，抑制促炎因子释放，达到神经保护作用，为缺血性脑卒中的治疗提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物：SPF级成年雄性SD大鼠120只[合格证号SCXK(川)2020-030,成都达硕实验动物有限公司]，体重220～280 g。饲养于陕西中医药大学中心实验室动物房，自由摄食、饮水，适应性喂养1周。本研究所有实验方案及实验手段均获得陕西中医药大学伦理委员会批准。

1.1.2 实验药物：通脉舒络胶囊(规格0.4 g/粒，批号20200321)；注射用青霉素钠盐80万U(批号200409)；0.9% 氯化钠注射液(100 ml/瓶，批号L116060801) 。

1.1.3 主要实验试剂及仪器：2%的2，3，5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染色液(批号G3005-500ml，北京索莱宝)；Rat IL-17A ELISA Kit(批号70-EK317/3-96，杭州联科)，RAT 维甲酸相关孤儿受体γt(Retinoic acid recept-related orphan receptor γt,RORγt) Elsia kit(批号ml560717-96，上海酶联)，4%组织固定液(批号AR1068，武汉博士德)，伊红染色液(批号G1100-500ml，北京索莱宝)，Cole苏木素染色液(批号G1140-500ml，北京索莱宝)。石蜡切片机(型号R2235，德国徕卡)；生物组织自动脱水机(型号TC-120S+，德国徕卡)；自动恒温烘片仪(型号TK-213，德国徕卡)；组织摊片、烤片机(型号TK-21811，德国徕卡)；冷冻台、包埋机(型号TB-7188L，德国徕卡)；高速离心机(型号SH01D，上海知信)；酶标仪(型号Multiskan FC，Thermo公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 实验动物模型制备：采用大脑中动脉栓塞法[7]制备大鼠缺血性中风模型，采用TTC染色确定模型制备是否成功。缺血1 h后，取出插入的线栓，使缺血区再灌注，手术过程中及术后至麻醉清醒前利用取暖器维持动物体温在正常范围，并给予大鼠青霉素4万U/只肌肉注射以预防感染。假手术组大鼠同上述操作方法，但仅分离血管，不插线栓。

1.2.2 实验动物分组及给药：成年雄性SD大鼠120只，体重220～280 g，随机分为五组，包括假手术组、模型组、通脉舒络低剂量组、通脉舒络中剂量组、通脉舒络高剂量组，每组24只。通脉舒络剂量组大鼠分别按照1 ml/100 g给予低、中、高浓度(0.032、0.064、0.128 g/ml)的通脉舒络胶囊药液灌胃，假手术组、模型组大鼠同样以1 ml/100g浓度的0.9%氯化钠溶液灌胃，各组大鼠均每天灌胃1次，且给予同样喂养方法。各组分别于模型建立后1、3、7、14 d进行神经功能缺损评分，每组每个时间点分配6只大鼠，评分结束后处死，取材。

1.2.3 取 材：各组大鼠于脑缺血再灌注1、3、7、14 d后分别进行神经功能缺损评分并记录。大鼠麻醉后摘除脾脏，用0.9%氯化钠溶液进行心脏灌注，迅速取脑，分离出全脑，一部分全脑分离出双侧海马置于2 ml离心管标记号后-80 ℃冰箱备用，一部分全脑冠状位用刀片切厚度约2～2.5 mm，剔除脑干、小脑部分，分别标记好后置于组织固定液中备用；摘除的脾脏用预冷等渗盐水冲净，去除其表面筋膜后用滤纸吸水称重后，切取一部分置于2 ml离心管标记好后-80 ℃冰箱保存备用；剩余部分置于4%多聚甲醛中固定。

1.2.4 梗塞灶TTC染色：大鼠麻醉后断头，迅速取出全脑，将脑组织置-20 ℃冰箱5～10 min后取出，置于新鲜冰块上，切去额极1 mm，间隔2 mm作大脑连续冠状切片，立即置于2%的TTC染液中，37 ℃水浴锅避光孵育15～20 min。取出后可见正常脑组织呈红色，梗塞区未被染色而呈白色。

1.2.5 神经功能缺损评分：按照Longa 5分法对大鼠进行神经功能缺损评分。0分为无神经功能损伤症状及体征；1分为不能够完全伸展左侧前爪；2分为爬行时向左偏斜或转圈，有追尾现象；3分为爬行时身体向左侧倾倒；4分为不能够自发爬行，意识丧失。根据评分结果，纳入1～3分的大鼠进行后续实验，若各组出现样本量不足，及时给予缺失组及时间点等量补充。

1.2.6 HE染色：每个大鼠样本随机选取脑切片进行HE染色，首先脱蜡至水，再用苏木素染色6 min，浸入分化液30 s后再用自来水浸泡15 min，然后用伊红染色2 min，自来水浸泡2～5 min后再用5%乙醇脱水至透明，最后封片、采集图像。

1.2.7 酶联免疫吸附法检测大鼠脑及脾脏匀浆中RORγt、白介素17(Interleukin-17，IL-17)含量：将组织取出解冻后，加入PBS溶液用匀浆机匀浆；取出96孔板，分别加入100 μl稀释好的标准品和稀释好的样品，37 ℃孵育90 min；吸干酶标板内反应液，加生物素标记抗体，37 ℃孵育60 min，1×洗涤缓冲液洗涤3次，每次浸泡1 min，加过氧化物酶标记的亲和素(ABC)，37 ℃孵育30 min，1×洗涤缓冲液洗涤5次，每次浸泡90 s，加入底物(TMB)，37 ℃孵育避光孵育20 min，加终止液，轻柔混匀；根据酶标仪器操作方法，上机检测OD值(450 nm处)，通过ELISA Cale软件计算获得所测物质浓度。

2 结 果

2.1 各组大鼠TTC染色结果 假手术组大鼠均未闭塞其大脑中动脉，故其TTC染色结果为明显红色，模型组及通脉舒络各剂量组均行造模术，故其缺血区显示为白色。

2.2 各组大鼠神经功能缺损评分比较 见表1。分别在再灌注1、3、7、14 d后进行神经功能缺损评分。假手术组大鼠未闭塞大脑中动脉，故其神经功能评分为0分。模型组神经功能缺损评分与假手术组比较，差异有统计学意义(P<0.01)。在1 d时的神经功能缺损评分中，通脉舒络各剂量组与模型组比较，差异无统计学意义(均P>0.05)。在3、7、14 d的神经功能缺损评分中，通脉舒络各剂量组与模型组比较，差异有统计学意义(均P<0.05)；其中通脉舒络中剂量组在各时间点的评分最低，与通脉舒络低剂量组、通脉舒络高剂量组比较，差异有统计学意义(均P<0.01)。

表1 各时间点各组大鼠神经功能缺损评分比较(分)

2.3 各组大鼠缺血脑组织病理形态变化 各个时间点观察到的假手术组大鼠脑海马CA1区神经细胞形态正常，结构完整，细胞排列层次分明，未见缺血或炎症细胞损伤现象，细胞密度大，细胞核呈类圆形，核膜清晰，核仁明显。

再灌注1 d时模型组及通脉舒络各剂量组海马CA1区表现为组织结构紊乱，呈现出区域性溶解、肿胀等坏死特征，空泡样改变明显，炎症细胞浸润现象明显(图1)。再灌注3 d时病理变化较1 d明显，而通脉舒络中剂量组的病理改变最少(图2)。再灌注7 d时通脉舒络各剂量组缺血海马区正常神经细胞数目明显减少，核固缩、溶解，胞间可见大小不等空泡；再灌注14 d时通脉舒络各剂量组海马CA1区空泡数量骤增，坏死组织已被清除。再灌注7、14 d时，通脉舒络各剂量组缺血区病理改变较模型组轻，炎症细胞损伤现象有所缓解，细胞排列较整齐，间质水肿程度减轻，细胞皱缩畸形、胞核固缩深染等表现明显减轻，其中通脉舒络中剂量组改善较为显著(图3、4)。

A：假手术组；B：模型组；C：通脉舒络低剂量组；D：通脉舒络中剂量组；E：通脉舒络高剂量组图1 各组大鼠再灌注1 d海马CA1区病理学形态(HE染色，×400)

A：假手术组；B：模型组；C：通脉舒络低剂量组；D：通脉舒络中剂量组；E：通脉舒络高剂量组图2 各组大鼠再灌注3 d海马CA1区病理学形态(HE染色，×400)

A：假手术组；B：模型组；C：通脉舒络低剂量组；D：通脉舒络中剂量组；E：通脉舒络高剂量组图3 各组大鼠再灌注7 d海马CA1区病理学形态(HE染色，×400)

A：假手术组；B：模型组；C：通脉舒络低剂量组；D：通脉舒络中剂量组；E：通脉舒络高剂量组图4 各组大鼠再灌注14 d海马CA1区病理学形态(HE染色，×400)

2.4 各组大鼠海马组织匀浆中RORγt、IL-17含量比较 见表2、3。各组大鼠造模后海马组织RORγt、IL-17含量均高于假手术组，再灌注1 d时模型组、通脉舒络低剂量组、通脉舒络中剂量组、通脉舒络高剂量组海马组织RORγt、IL-17含量均高于假手术组，差异有统计学意义(均P<0.01)。再灌注3 d时造模大鼠海马组织RORγt、IL-17含量升至高峰。再灌注7、14 d模型组、通脉舒络低剂量组、通脉舒络中剂量组、通脉舒络高剂量组海马组织RORγt、IL-17含量均有所下降，且通脉舒络中剂量组大鼠海马内RORγt、IL-17含量最低，与通脉舒络低剂量组、通脉舒络高剂量组比较，差异有统计学意义(均P<0.01)。

表2 各组大鼠海马组织RORγt含量比较(ng/ml)

表3 各组大鼠海马组织IL-17含量比较(pg/ml)

2.5 各组大鼠脾脏组织匀浆中RORγt、IL-17含量比较 见表4、5。与假手术组比较，造模成功大鼠的脾脏RORγt、IL-17含量均较高。再灌注1、3、7、14 d模型组、通脉舒络低剂量组、通脉舒络中剂量组、通脉舒络高剂量组脾脏RORγt、IL-17含量均高于假手术组脾脏RORγt、IL-17含量(均P<0.01)；其中再灌注3 d时含量达高峰。通脉舒络中剂量组大鼠脾脏中RORγt、IL-17含量最低，与通脉舒络低剂量组、通脉舒络高剂量组大鼠脾脏中RORγt、IL-17含量比较，差异有统计学意义(均P<0.01)。

表4 各组大鼠脾脏组织RORγt含量比较(ng/ml)

表5 各组大鼠脾脏组织IL-17含量变化(pg/ml)

3 讨 论

缺血性脑卒中属于中医学“中风”范畴，病位在脑，与气血密切相关[8]。中医认为气血是大脑生长发育及功能活动的物质基础[9]，脑为元神之府，血液是神志活动的物质基础，大脑必须通过气血的温煦、濡养，才能发挥正常的生理功能，所以缺血性中风的基本病机是气血失调。清代医家王清任创立“气虚血瘀”理论，开益气活血化瘀法治疗中风病之先河，其创立的补阳还五汤，成为治疗中风气虚血瘀证的经典名方[10]。国医大师张学文认为因虚致瘀，瘀阻脉络是中风发病的根本，瘀血贯穿中风之始终，并根据缺血性中风的发病机制及长期临床实践提出气虚血瘀证是缺血性中风的常见证型[11-12]。其课题组经过多年的研究和探索制订了益气养血、活血化瘀、通脉舒络的治则，并在此基础上，拟定了黄芪、丹参、赤芍、川芎、地龙、红花、当归、水蛭为成分的通脉舒络方，由该方制成的通脉舒络胶囊是陕西中医药大学附属医院的协定处方制剂，在治疗缺血性中风气虚血瘀证中取得了较好疗效。中医理论认为气行则血行，气滞则血瘀，方中用大剂量黄芪补中益气，为君药；丹参活血祛瘀，赤芍清热凉血、散瘀止痛，川芎活血行气、祛风止痛，地龙清热、通络，水蛭破血通经、逐瘀消癥，红花活血化瘀，通脉舒络共为臣药；佐以当归补血活血，改善缺血性中风血虚症状；全方共奏益气养血、活血化瘀、通脉舒络之功效。现代药理学研究表明，黄芪主要成分黄芪甲苷[13]、丹参提取物丹酚酸A[14-15]、当归[16-17]等的有效成分对机体有抗炎、抗氧化、抗兴奋性毒性和免疫调节作用，可活化T淋巴细胞，加速脾细胞分裂，使T细胞功能增强。

T淋巴细胞通过参与适应性免疫系统影响缺血性卒中发生，具有调节免疫的作用，可分为CD8+细胞毒性T细胞和CD4+辅助性T(Th)细胞，其中Th17主要通过表达促炎细胞因子来介导脑缺血后炎症反应[18]。Th17细胞的特异性转录因子是RORγt，可诱导和编码IL-17A和IL-17F的基因表达。Th17通过产生多种细胞因子发挥作用，IL-17是其最重要的效应因子。张立堂等[19]研究表明，急性脑梗死患者外周血中Th17细胞及IL-17水平均高于正常，说明Th17细胞可能参与脑梗死的发病过程。刘贵香等[20]发现脑梗死患者外周血中存在 IL-17A、IL-23、 IL-6、RORγt、Th17 的增高，说明Th17细胞参与了缺血性脑卒中的病理生理过程。脾脏作为主要的外周免疫器官，在脑缺血诱导的免疫反应中也起着重要作用[21]。

本研究中以通脉舒络胶囊为给药组，观察大鼠神经功能缺损评分变化、脑组织病理改变，并检测脑、脾脏RORγt、IL-17指标含量的变化。通脉舒络胶囊治疗3 d以后，各给药组大鼠神经功能缺损评分较模型组开始降低，其中通脉舒络中剂量组评分降低最为明显，说明通脉舒络胶囊可以减缓缺血性中风大鼠神经功能缺损程度，具有神经保护作用。缺血性脑卒中后，脑组织内的神经细胞逐步发生变性、坏死、肿胀及溶解，最终导致脑组织形态和结构破坏。给药7 d后，各剂量组脑组织缺血区病理改变较模型组减轻，炎症细胞损伤现象有所缓解，细胞排列较整齐，间质水肿程度减轻，细胞皱缩畸形、胞核固缩深染等表现明显减轻。由此可知，通脉舒络胶囊能改善缺血脑组织神经细胞的炎性损伤。模型组脑及脾脏RORγt、IL-17含量在造模后逐渐升高，于3 d后达到顶峰，7、14 d的含量较假手术组仍有升高，说明Th17不仅参与了缺血性脑卒中发展过程，且随着再灌注时间延长Th17比例也在发生变化，脑缺血损伤的同时，局部及外周免疫炎症反应也被激活，而当给予通脉舒络胶囊治疗后，各时间点缺血大鼠脑及脾脏内RORγt、IL-17含量较模型组降低，其中通脉舒络中剂量组改变最为明显，进一步说明通脉舒络胶囊能降低大鼠缺血脑组织局部及外周免疫器官脾脏内的Th17细胞比例，改善缺血性脑卒中引起的Th17细胞亚群功能的失衡状态。

综上所述，本研究发现，通脉舒络胶囊通过抑制脑缺血后局部及外周的炎症反应，抑制炎症细胞因子产生，发挥神经保护作用。本研究旨在探究Th17细胞在缺血性中风发展过程中的变化，但实验观察的时间点不够细化，在接下来的研究中拟增加更多的时间点，并进行通脉舒络胶囊对抗炎因子影响的观察。