钾元素对苹果树腐烂病菌生长发育的影响

李玉玲，杨军玉，韩泽园，孟祥龙，曹克强，王树桐

（河北农业大学 植物保护学院，河北 保定 071001）

由黑腐皮壳菌（Valsa maliMiyabe et Yamada）引起的苹果树腐烂病是危害我国苹果的主要病害之一［1-2］，严重发生时可导致毁园［3-4］，影响了我国苹果产业的健康发展［5］。矿物质元素在病原真菌和寄主植物的生长发育中均起着至关重要的作用［6-7］，可以通过影响寄主对病原物的抗性或易感性，寄主的组织学或形态结构或性能，以及病原物的表观毒力和存活能力等来影响病害严重程度［8-9］。而钾作为植物生长所需的大量元素，在植物生长发育中起着至关重要的作用［10-11］。Perrenoud［12］综述了关于钾和植物健康的近2 450 篇文献，发现在大多数情况下，钾的使用降低了真菌病害的发病率。Wang J等［13］发现钾含量与腐烂病发生的严重程度呈密切相关。马宏彪研究表明在苹果叶片中钾含量达到1.25%时，腐烂病在苹果树上不会发生［14］。而后有研究发现，提高苹果树的钾含量可减少腐烂病的发生率和严重程度，特别是当叶片钾含量大于1.30%时，腐烂病菌侵染受到严重限制甚至难以侵染［15］。吕宁等的研究也表明，随着枝条含钾量的降低，腐烂病发生程度加重［16］。这些研究表明，树体中钾元素可以影响苹果树腐烂病的发生和发展，但是这些研究都认为钾元素对树体的影响是腐烂病发生程度发生变化的原因。而针对钾元素对腐烂病菌本身的影响尚未见报道。本研究以不同浓度钾元素对腐烂病菌生长发育的影响作为切入点，系统研究了不同浓度钾元素对腐烂病菌菌丝生长速率、干重、菌丝形态、孢子萌发等病菌生长发育过程的影响，通过钾元素调控病菌的侵染，降低腐烂病危害，并为苹果产业农药减施增效提供理论依据。

1 材料方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌株 苹果腐烂病菌Vm470 菌株，采集自陕西省礼泉县，由国家苹果产业技术体系病虫害防控研究室提供。

1.1.2 供试培养基 所有处理组均使用灭菌的KCl粉剂，以纯钾(K2O)含量作为培养基钾含量标准，KCl 处理浓度梯度参考孙广宇等人苹果树叶钾含量完全抑制腐烂病发生时的钾含量［14,17］，经测定未经任何处理的半量PDA、半量PDB 的平均纯钾含量为0.22 g/L（c(K2O)=c(KCl)×0.63）。PDA 培养基：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂粉17 g，水1 000 mL。半量PDA 培养基：马铃薯100 g，葡萄糖10 g，琼脂粉17 g，水1 000 mL。半量PDB 培养基：马铃薯100 g，葡萄糖10 g，水1 000 mL。这3 种培养基均经121 ℃，20 min 高压蒸汽灭菌。大麦粒培养基：每个100 mL 锥形瓶称取浸泡好的大麦粒35 g，6%蜂蜜水10 mL 和1%蛋白胨10 mL，121 ℃，60 min高压蒸汽灭菌。

1.2 方法

1.2.1 不同浓度钾对腐烂病菌菌丝生长速率的影响 将PDA 培养2 d 的Vm470 菌落边缘用打孔器（ø=5.0 mm）打取菌饼，将菌饼置于分别含有0.22、0.85、1.48、2.11、3.37、4.63、6.25、8.41、9.04、10.93、12.82、14.7、16.60 和19.12 g/L K2O的半量PDA（20 mL/皿）平板中培养，每个处理5次重复。置于（25±2）℃培养箱内，分别黑暗培养24，36 和48 h 后，采用十字交叉法测量各处理菌落直径的大小并记录。

1.2.2 不同浓度钾对腐烂病菌菌丝形态的影响 将腐烂病菌菌饼置于分别含有0.22、1.48、3.37、6.52、9.04、12.82、16.60 和20.83 g/L K2O 的半量PDA（20 mL/皿）平板上，（25±2）℃黑暗培养，3 d后观察菌落形态，显微观察菌丝形态并拍照。

1.2.3 不同浓度钾对腐烂病菌菌丝干重的影响 将菌饼置于分别含有0.22、1.48、2.11、3.37、4.63、6.52、8.41、10.93、12.82、14.71、18.49、22.27、26.05 和29.20 g/L K2O 的半量PDB（100 mL/瓶）中，（25±2）℃ 140 r/min 摇床内摇培72 h 后，取出菌丝团，置于锡箔纸上，80 ℃ 恒温烘干至恒重，称量菌丝团干重。

1.2.4 不同浓度钾对腐烂病菌分生孢子萌发的影响 将菌饼置于大麦培养基中，于（25±2）℃ 恒温培养箱中黑暗培养7 d，使用黑光灯照射12 h/d，直至产生孢子角。挑取新鲜的分生孢子角，制备孢子悬浮液［18］，浓度为1×105～1×106个/mL。在分别含有0.22、1.48、3.37、5.26、8.41、9.04、10.93、12.82、16.60、20.38 和22.90 K2O 的半量PDB 和半量PDA 培养基。

取50 μL 孢子悬浮液涂布平板，分别在18 和24 h 后检查分生孢子萌发率。检查时取培养皿上均匀分布的3 个点切取1 cm2的小块，放在载玻片上，在显微镜下检查孢子萌发状况，每个小块检查100个孢子。

1.2.5 不同浓度钾对腐烂病菌致病力的影响 分别用K2O 含量为0.22、3.37、7.78、12.82、16.60 和19.12 g/L的半量PDA 培养基培养腐烂病菌2 d 后，使用打孔器（ø=5.0 mm）在菌落边缘取新鲜菌丝，针刺接种至大小一致，健康的富士苹果上，每组处理9 个苹果，25 ℃保湿培养7 d 后，使用十字交叉法测量病斑横、纵径，计算病斑面积，并拍照记录；用电烙铁在生长状况一致且健康的1 ～2 年生王林离体枝条上，距顶端 10 cm 处造成1 个烫伤伤口，隔15 cm 再烫伤1 个伤口，每个处理15 支枝条，每支枝条2 个伤口，将菌饼接种于枝条烫伤处，枝条两端使用固体石蜡25 ℃ 保湿培养10 d 后［19］，使用游标卡尺测量枝条上下截面直径，使用直尺测量枝条长度，计算树枝表面积；十字交叉法测量病斑横、纵径，计算病斑面积，并拍照记录。

分别将未经任何处理的野生型Vm470 和KVm470 接种到生长状态一致且健康的1 ～2 年生王林枝条上，方法同上，每组10 支枝条，25 ℃保湿培养10 d 后拍照记录观察病斑情况，

枝条发病率（%）=发病组织数/接种组织数×100

病斑面积（mm2）=π(圆周率)×a×b(其中a,b分别是病斑横纵半径)

1.2.6 数据统计与分析 数据整理及作图所用软件为 Microsoft Office Excel 2010，使用 SPSS22.0 软件，LSD 法进行多元统计分析，p＜0.05。

2 结果与分析

2.1 不同浓度钾元素对腐烂病菌菌丝生长的影响

如图1 所示，钾元素对于腐烂病菌菌丝生长的影响呈现低浓度促进高浓度抑制。当纯钾含量为3.37 g/L 时，腐烂病菌菌丝生长速率最快，达到32 mm/d；钾元素浓度高于此浓度后，腐烂病菌菌丝生长速率开始下降，当纯钾含量高于8.41 g/L 时，开始抑制腐烂病菌菌丝的生长。

图1 不同浓度钾元素对苹果树腐烂病菌菌丝生长速率的影响Fig.1 Effects of different concentrations of potassium on mycelial growth rate of apple tree Valsa mali

2.2 不同浓度钾元素对腐烂病菌菌丝形态的影响

正常的腐烂病菌菌落，菌丝长势基本一致，呈现均匀的圆形菌落；显微镜下观察发现，正常生长的病菌菌丝细而直，粗细均匀一致，表面光滑，分枝间距较大，距离顶端较远，并且分支长势良好（图2-a）。与正常生长的病菌菌丝相比，在纯钾含量为1.48 g/L 和3.37 g/L 的腐烂病菌（图2-b,c），整体菌落形态无明显变化，但生长速率较正常菌丝更快；粗细无明显变化，但是分支明显增多，分支间距缩短、变密集，这也与菌落生长速率明显增快相一致。而当纯钾浓度为6.52 g/L 时，菌落边缘开始呈现不规则且分层；菌丝分枝数减少并且出现分支长度较短（图2-d）。当纯钾含量在9.04 g/L 和12.82 g/L 时（图2-e,f），菌落边缘呈现不规则羽状，分层现象明显，菌落表面略微油渍状态；菌丝体变得纤细，菌丝分枝数急剧减少，分支间距增大，且大多数分支发育受阻。当纯钾含量高于12.82 g/L 时，腐烂菌菌落边缘呈不规则雪花状，菌落表面油污状；菌丝体明显变细且表面粗糙弯曲畸形，分枝数很少，且大多数分支不能正常发育（图2-g,h）。

图2 不同浓度钾元素对腐烂病菌菌丝形态的影响Fig.2 Effects of different concentrations of potassium on the mycelial morphology of Valsa mali

2.3 不同浓度钾元素对腐烂病菌菌丝干重的影响

菌丝干重受到钾元素影响的规律与菌丝生长速率的规律基本一致，即低浓度促进高浓度抑制（图3），当纯钾含量低于9.04 g/L 时促进腐烂病菌菌丝生长，此时腐烂病菌的干重均高于对照组。而当纯钾含量高于9.04 g/L 时，腐烂病菌菌丝生长受到抑制，菌丝干重均显著低于对照组。

图3 不同浓度钾元素对苹果树腐烂病菌菌丝干重的影响Fig.3 Effects of different concentrations of potassium on dry weight of apple tree Valsa mali

2.4 不同浓度钾元素对腐烂病菌孢子萌发的影响

不同钾浓度对腐烂病菌分生孢子萌发的影响与对菌丝的影响规律基本一致。不同的是低浓度钾含量并不能促进腐烂病菌分生孢子萌发（图4）。但当纯钾含量小于9.04 g/L 时，孢子萌发率在80%以上；当纯钾含量达到22.9 g/L 时，基本可以完全抑制孢子萌发。相同的是当纯钾含量低于9.04 g/L 时对孢子萌发抑制程度相对较低，萌发率高达80%，高于9.04 g/L时孢子萌发受到的抑制作用迅速增强，在12.82 g/L 时，孢子萌发率下降至44.4%。当纯钾含量为22.9 g/L 时，孢子萌发几乎受到完全抑制。

图4 不同浓度钾元素对苹果树腐烂病菌孢子萌发率的影响Fig.4 Effects of different concentrations of potassium on spore germination rate of apple tree Valsa mali

2.5 不同浓度钾元素对腐烂病菌致病力影响

用经不同钾浓度处理的腐烂病菌接种苹果果实均能发病，但随着钾浓度的增加，腐烂病菌在苹果果实上造成的病斑面积略有降低，在纯钾含量为16.6 g/L时相较于野生型菌株接种处理出现了极显著的差异，但不同处理间的病斑大小无明显规律（图5）。

图5 不同浓度钾元素对苹果树腐烂病菌在苹果果实上的致病力测定Fig.5 Determination of pathogenicity of different concentrations of potassium on apple fruit Valsa mali

用经不同钾浓度处理的腐烂病菌接种苹果离体枝条，发病率均达到80 %以上，当纯钾浓度为3.37 g/L 时病斑面积显著高于其他处理（P<0.05），其他处理之间无显著差异（见图6）。

图6 不同浓度钾元素对苹果树腐烂病菌在苹果枝条上的致病力测定Fig.6 Different concentrations of potassium on the apple tree Valsa mali pathogenic force measurement in apple branches

为了进一步研究钾元素对腐烂病菌的影响，从经19.12 g/L 高钾处理的腐烂病菌接种发病的果实上分离获得1 株腐烂病菌菌株，命名为KVm470。并对野生菌株Vm470 及高钾分离菌株KVm470 进行致病性测定，其中野生型的发病率高达95%，KVm470 的发病率只有55 %。KVm470 与野生型Vm470 的发病情况相比，发病率、病斑面积及相对病斑面积均显著低于野生型（图7），这表明经高钾处理后腐烂病菌致病力下降，且具有一定程度的可遗传性。

图7 Vm470 和KVm470 在枝条上的致病性测定Fig.7 Vm470 and KVm470 from the branches of pathogenic determination

3 讨论与结论

本研究发现，钾元素对腐烂病菌菌丝生长速率及干重影响规律基本一致，均呈低浓度促进高浓度抑制的关系，而与其孢子萌发率呈显著的负相关关系。在腐烂病菌菌丝生长率及干重测试中，钾离子对菌丝生长从促进转为抑制的拐点浓度分别为8.41 和9.04 g/L。孙广宇等［17］研究发现，当叶片钾含量＜9 mg/g 时，叶片钾含量与腐烂病的发生程度呈极显著的负相关关系，因此，本研究中菌丝干重试验中的9.04 g/L 作为从促进转向抑制的拐点浓度，与孙广宇等的研究结果高度吻合。同时，本研究还发现，当钾含量＞9.04 g/L 时，对腐烂病菌分生孢子萌发的抑制显著提高，当钾元素含量达到12.82 g/L 及以上浓度时，孢子萌发率急剧下降至44%以下。已有研究认为在腐烂病菌侵染发育后期主要靠病原菌在病斑处产生分生孢子感染苹果树皮［20-21］，因此树皮中钾含量达到9 mg/g 及以上浓度时，病菌孢子萌发侵染和菌丝扩展都会受到抑制。同时，在果园中发现当枝条钾含量超过7.5 g/kg 时，果树韧皮部厚度就会增加，产生木质化-木栓化阻隔带［16］，这时苹果树腐烂病菌可以定殖但不能有效降解木质部导管 ，从而阻隔了病斑扩展。这些研究结果表明，钾元素对苹果树腐烂病发生的影响既包括提升寄主的抗病性，也包括对病菌侵染和扩展的直接抑制作用。

在致病性分析试验中发现，除去极个别差异外，受到不同浓度钾元素处理的腐烂病菌接种在果实及枝条上时所产生的病斑长度和面积均无显著差异，这与刘向阳等人的研究结论基本一致［21］。但是从19.12 g/L 高钾处理接种的病果上分离出的KVm470的致病能力明显小于野生型Vm470。综合来看，腐烂病菌在培养基上所受到的生长抑制在接种寄主时并未对其致病力产生相应的影响，这可能是腐烂病菌恢复至正常生长环境条件所产生的应激反应。但本研究还发现，高钾分离菌株KVm470 的致病力与Vm470 相比受到了明显的抑制，这表明钾元素在影响腐烂病菌生长、菌丝形态及孢子萌发的同时，也很有可能在一定程度上改变了其遗传分子水平。即便是盐胁迫下所产生的应激反应可以暂时性保留腐烂病菌的致病能力，但是其生长发育受到的抑制作用是显而易见的，所以在实际生产中防治腐烂病菌，可以先在病斑处喷施或注射钾盐再搭配杀菌剂使用就可以更加有效的抑制腐烂病菌的扩散，这也避免了过量施用钾肥造成苹果苦痘病发生的弊端［22］。下一步通过探究钾元素调控苹果树腐烂病菌致病力变化的分子机制，将为寻找新的抗腐烂病菌靶标提供理论基础。