外周血Circ_0070934/miR⁃199a⁃5p/MGAT3 作为生物标志物在过敏性鼻炎⁃哮喘综合征中的诊断价值

胡钰洁，吴 迪，黄燕华，刘志光，施宇佳，张 倩

南京医科大学附属常州第二人民医院呼吸与危重症医学科，江苏 常州 213003

支气管哮喘（哮喘）是一种反复发作的慢性气道疾病，以慢性气道炎症、气道高反应、可逆性气流受限和气道重塑为特征，表现为反复发作的喘息、气促、胸闷、咳嗽等呼吸道症状［1］。过敏性鼻炎和哮喘分别表现为上呼吸道和下呼吸道炎症，两者在病因、免疫学和发生机制等方面均极为相似，因此，根据“同一气道、同一疾病”概念，近年来提出过敏性鼻炎⁃哮喘综合征（combined allergic rhinitis and asth⁃ma syndrome，CARAS）这一新医学诊断名称，指同时发生的临床或亚临床上呼吸道过敏（过敏性鼻炎）和下呼吸道过敏性症状（哮喘）［2］。

非编码RNA（non⁃coding RNA，ncRNA）是指转录组中不翻译为蛋白质的RNA分子，包括长链非编码RNA（long non⁃coding RNA，lncRNA）、微小RNA（microRNA，miRNA）、环形RNA（circular RNA，circ⁃RNA）等［3］。ncRNA在过敏性疾病（包括过敏性鼻炎和哮喘）的发生发展中发挥重要作用，参与了气道炎症应答、气道重塑、气道高反应、上皮分化、黏液生成等重要过程，并有望成为疾病诊断的生物标志物和治疗靶标［4］。研究报道，miR⁃199a⁃5p在中性粒细胞哮喘患者外周血及诱导痰液中的表达升高，并且和肺功能呈负相关［5］，但在CARAS患者中的表达水平变化及相关研究未见文献报道。本研究通过circBANK 基因库预测到环形RNA circ_0070934 与miR⁃199a⁃5p 结合，并且通过Targetscan 预测miR⁃199a⁃5p 靶向调控甘露糖甙乙酰氨基葡糖转移酶（mannoside acetylglucosaminyltransferase 3，MGAT3）。本研究旨在通过比较CARAS患者和健康对照外周血中circ_0070934/miR⁃199a⁃5p/MGAT3 的表达差异，探讨其作为CARAS早期诊断生物标志物的价值，评估其与CARAS患者相关临床指标之间的相关性，为进一步研究其在CARAS发生发展中的机制打下基础。

1 对象和方法

1.1 对象

本研究于2020 年7 月—2021 年12 月在南京医科大学附属常州二院呼吸与危重症医学科门诊收集38 例CARAS 患者和43 例性别、年龄匹配的健康对照。过敏性鼻炎诊断标准参照中国过敏性鼻炎诊治指南［6］，哮喘诊断根据我国2020版支气管哮喘防治指南［7］，CARAS 的诊断须同时符合过敏性鼻炎和哮喘的诊断标准。正常对照组为健康志愿者，无哮喘和过敏性鼻炎病史，无其他过敏性及免疫系统疾病等。CARAS患者为初诊患者，未使用抗哮喘药物。所有受试者均需排除合并感染、肺栓塞、慢性阻塞性肺疾病、肺结核、血液系统疾病及肝脏功能异常等疾病，均进行血常规、肝功能、肾功能、血糖、血脂以及心电图等检查以排除基础疾病。所有受试者均需签署知情同意书，本研究获得南京医科大学附属常州二院伦理委员会批准（批件号：［2020］KY213⁃01）。

1.2 方法

1.2.1 采集血液样本

用EDTA抗凝管收集患者和健康对照的静脉外周血10 mL，其中5 mL 低速离心机3 000 r/min 离心10 min，分离血清，用于ELISA 测量MGAT3 蛋白水平；另留存5 mL 全血用于qRT⁃PCR 测定circ_0070934、miR⁃199a⁃5p及MGAT3的表达水平。所有受试者的血液样本均储存于-80 ℃。

1.2.2 ELISA测定

人MGAT3 ELISA试剂盒（上海科兴生物科技有限公司）对CARAS 患者和对照组血清样本中MGAT3的含量进行检测，严格按照试剂盒说明书进行实验和操作。

1.2.3 qRT⁃PCR检测

使用RNAliquid 超速全血总RNA 提取试剂盒（北京汇天东方科技有限公司）提取总RNA，实验步骤按照说明书进行。使用紫外线分光光度计对提取的RNA 浓度及纯度进行检测。采用FastQuant cDNA 第一链合成试剂盒（北京天根生化科技有限公司）进行反转录，合成mRNA cDNA/circRNA cDNA。采用miRNA 第一链cDNA 合成（加尾法）（上海生工生物工程股份有限公司）进行反转录。使用Super⁃Real PreMix Plus（SYBR Green）（北京天根生化科技有限公司）对mRNA和circRNA进行扩增，使用miR⁃NA 荧光定量PCR 试剂盒（染料法）（上海生工生物工程股份有限公司）对miRNA 进行扩增，用ABI 7300型荧光定量PCR仪，采用2-ΔΔCT法进行数据的相对定量分析。circ0070934 的内参为GAPDH，MGAT3 的内参为GAPDH+ACTB，miRNA 的内参为U6。MGAT3、circ_0070934、ACTB、GAPDH 的上下游引物和miR⁃199a⁃5p的上游引物由北京博迈德公司合成，U6 的上下游引物和miR⁃199a⁃5p 的下游引物为miRNA 荧光定量PCR 试剂盒提供的通用引物。引物序列如下：MGAT3（F：5′⁃TCCTGTTTCCCT⁃CACTGTGC⁃3′；R：3′⁃ACACACGCACAA⁃ACAT⁃GAGC⁃5′）；circ_0070934（F：5′⁃GGTGAAAG⁃GACT⁃GATCAACCAT⁃3′；R：5′⁃TGTCTTGAGCTT⁃TCCT⁃GCCT⁃3′）；miR⁃199a⁃5p（F：5′⁃CCCAGTGTT⁃CAGACTACCTGTTC⁃3′）；ACTB（F：5′⁃TCCGCAAA⁃GACCTGTACGC⁃3′；R：5′⁃CTGGAAGGTGGACAGC⁃GAG⁃3′）；GAPDH（F：5′⁃TCGACAGTCAGCCGCAT⁃CTTCTTT⁃3′，R：5′⁃ACCAAATCCGTTGACTCCGAC⁃CTT⁃3′）。

1.3 统计学方法

采用SPSS 21.0 统计软件，计量资料采用Kol⁃mogorov⁃Smirnov 检验进行正态性检验，对符合正态分布的计量资料以均数±标准差（）表示，不符合正态分布的计量资料以中位数（四分位数）［M（P25，P75）］表示，分类变量资料以比例表示，两样本比较采用t检验（正态分布的资料）或Mann⁃WhitneyU检验（非正态分布资料），相关关系采用Pearson 相关分析（正态分布的资料）或Spearman 秩相关分析（非正态分布的资料），受试者操作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲线判断诊断灵敏度与特异度，通过曲线下面积（area under the curve，AUC）判断诊断效果，AUC=0.5，无诊断价值，AUC 越接近1，提示诊断越准确，P<0.05 为差异有统计学意义（双尾法）。

2 结果

2.1 研究对象的临床特征

本研究纳入38 例CARAS 患者及43 例健康对照，两组年龄、性别、体重指数（body mass index，BMI）匹配。与健康对照组相比，CARAS 组患者肺功能第1 秒用力呼气容积占预计值百分比（percent predicted forced expiratory volume in one⁃ second，FEV1%pred）及第1 秒用力呼气容积占用力肺活量比值（the first second forced expiratory volume ratio of forced vital capacity，FEV1/FVC）显著降低（P<0.05），而嗜酸性粒细胞（eosinophils，EOS）绝对值、EOS 比例及呼出气一氧化氮（FeNO）明显高于对照组（P<0.001，表1）。

表1 研究对象临床特征Table 1 Clinical characteristics of subjects

2.2 CARAS 组与健康对照组血浆MGAT3 的表达水平

ELISA 实验结果显示，CARAS 组患者外周血血浆MGAT3 的表达量（0.20±0.05）较对照组（0.32±0.31）明显下降（P=0.035，图1）。

图1 CARAS组与健康对照组血浆MGAT3的表达水平Figure 1 Expression level of plasma MGAT3 in CARAS group and healthy control group

2.3 CARAS 组与健康对照组circ_0070934、miR⁃199a⁃5p及MGAT3的表达水平

qRT⁃PCR 结果显示，与健康对照组相比，MGAT3 在CARAS 组中表达明显降低（图2A，P<0.001），circ_0070934 在CARAS 组中表达也明显降低（图2B，P=0.001），而miR⁃199a⁃5p 的表达量则明显上调（图2C，P=0.013）。

图2 CARAS组与健康对照组外周血中MGAT3、miR⁃199a⁃5p和circ_0070934表达水平Figure 2 Expression levels of MGAT3，miR⁃199a⁃5p and circ_0070934 in peripheral blood of CARAS group and healthy control group

2.4 circ_0070934/MGAT3/miR⁃199a⁃5p 与CARAS患者临床指标的相关性

CARAS 患者外周血MGAT3 mRNA 水平与EOS绝对值（r=0.412，P=0.011）、EOS 比例呈正相关（r=0.469，P=0.003），circ_0070934 与EOS 绝对值（r=-0.516，P=0.001）、EOS 比例呈负相关（r=-0.348，P=0.035）（表2，图3）。MGAT3、circ_0070934与FeNO、FEV1%pred 及FEV1/FVC 没有相关性。miR⁃199a⁃5p与EOS 绝对值、EOS 比例、FeNO、FEV1%pred 及FEV1/FVC均没有明显相关性（表2）。

图3 circ_0070934/MGAT3与CARAS患者临床指标的相关性Figure 3 Correlation between circ_0070934/MGAT3 and clinical indexes of CARAS patients

表2 circ_0070934/miR⁃199a⁃5p/MGAT3与CARAS患者临床指标的相关性Table 2 Correlation between circ_0070934/miR⁃199a⁃5p/MGAT3 and clinical indexes of CARAS patients

2.5 circ_0070934/miR⁃199a⁃5p/MGAT3 在CARAS中的诊断效果

ROC 曲线分析以评估MGAT3、miR⁃199a⁃5p 和circ0070934 作为CARAS 生物标志物的价值（表3、图4）。当界值（cut⁃off value）为0.208 时，MGAT3 mRNA作为CARAS 生物标志物的灵敏度为73.7%，特 异度 为100.0%，AUC 为0.933（95%CI：0.882～0.984，P<0.001），此指标作为CARAS 生物标志物的诊断价值最佳。多因素联合诊断ROC 曲线分析（表3、图5），当界值为0.539 时，MGAT3、miR⁃199a⁃5p 与circ_0070934 作为联合诊断CARAS 的生物标志物的灵敏度为92.1%，特异度为93.0%，AUC 为0.959（95%CI：0.916～1.000，P<0.001）。

图4 MGAT3、miR⁃199a⁃5p 和circ_0070934 作为CARAS生物标志物的ROC曲线分析Figure 4 ROC curve analysis of MGAT3，miR⁃199a⁃5p and circ_0070934 as CARAS biomarkers

图5 MGAT3、miR⁃199a⁃5p和circ_0070934作为CARAS生物标志物的多因素联合ROC曲线分析Figure 5 Multivariate combined ROC curve analysis of MGAT3，miR⁃199a⁃5p and circ_0070934 as CARAS biomarkers

表3 MGAT3、miR⁃199a⁃5p和circ_0070934作为CARAS生物标志物的价值Table 3 Value of MGAT3，miR⁃199a⁃5p，circ_0070934 as biomarkers of CARAS

3 讨论

过敏性鼻炎和哮喘被认为是同一疾病的两种表现，80%的哮喘患者患有过敏性鼻炎，而60%的过敏性鼻炎会发展为哮喘［2，8］。目前CARAS的诊断主要参照过敏性鼻炎和哮喘的两个诊治指南，尚无CARAS 相关诊断生物标志物的报道。本研究首次在CARAS 患者外周血中检测circ_0070934/miR⁃199a⁃5p/MGAT3 水平，发现circ_0070934 与MGAT3的表达较健康对照下调，而miR⁃199a⁃5p 的表达水平上调。

研究报道，miR⁃199a⁃5p在中性粒细胞哮喘患者外周血及诱导痰液中的表达升高，并且和肺功能呈负相关，但与外周血EOS 无相关性［5］。本研究也未发现miR⁃199a⁃5p与CARAS患者EOS之间存在相关性，提示miR⁃199a⁃5p可能不参与调节EOS。但本研究发现CARAS患者的外周血circ_0070934表达水平与EOS绝对计数和EOS比例都呈负相关，MGAT3的表达水平则与之呈正相关，提示circ_0070934 和MGAT3可能与EOS炎症密切相关，其具体机制有待进一步研究。

本研究用ROC 曲线分析circ_0070934、miR⁃199a⁃5p 和MGAT3 在CARAS 中的诊断价值，发现MGAT3取界值为0.208时，灵敏度和特异度高（分别为73.7%和100.0%），为最佳参数。其次是circ_0070934，取界值为0.620 时，灵敏度为71.1%，特异度为69.8%。而miR⁃199a⁃5p则相对较低，取界值为1.166 时，灵敏度为55.3%，特异度为72.1%。另外，本研究又对这些指标进行了多因素联合的ROC曲线分析，发现当circ_0070934、miR⁃199a⁃5p 和MGAT3 3 个指标联合时，对CARAS 的诊断价值最高，取界值为0.539 时，灵敏度为92.1%，特异度为93.0%。可以看出，在单因素诊断CARAS 时，MGAT3的诊断价值最高，但多因素联合诊断的价值要明显高于单因素，尤其是circ_0070934、miR⁃199a⁃5p 和MGAT3 3个检测指标联合后，对于CARAS 的诊断有着非常重要的意义。因此，外周血circ_0070934、miR⁃199a⁃5p 和MGAT3 都可以作为诊断CARAS 的潜在生物标志物，值得扩大样本进一步验证。

上皮⁃间充质转化（epithelial⁃mesenchymal tran⁃sition，EMT）是上皮细胞呈现迁移性间充质表型的过程，EMT 可分为3种类型，Ⅰ型与胚胎着床、发育和器官形成相关，Ⅱ型与损伤修复、组织再生、纤维化和炎症相关，Ⅲ型参与了癌症的进展和转移。其中，与特应性疾病相关的Ⅱ型EMT，对肺、鼻腔、肠道和皮肤的上皮更新和炎症有很大影响［9］。EMT对正常组织修复和通过多种炎症途径发出信号至关重要。支气管上皮细胞EMT 的增加会导致支气管哮喘屏障功能障碍。支气管哮喘的典型特征即慢性气道炎症、气道重塑、气道高反应和可逆性气流受限，气道重塑过程涉及气道上皮细胞中纤维母细胞的增加，最终导致纤维化，而EMT 可以解释这些纤维母细胞的起源［10］。EMT 在过敏性鼻炎中的研究相对较少，并且大多数研究主要使用患者的慢性鼻窦炎组织，通过活检组织中EMT标志物将其分为发生鼻息肉和未发生鼻息肉的亚型［11］。

MGAT3基因最初在母鸡输卵管中被发现，由它编码的N⁃乙酰氨基葡萄糖转移酶3（N⁃acetylglucos⁃aminyltransferase Ⅲ，Gnt Ⅲ），参与了多种肿瘤的EMT 过程，对肿瘤细胞的迁移有调控作用［12］。在TGF⁃β1诱导处理的人肝癌细胞中，GnT Ⅲ基因表达及其催化产物——平分型N⁃乙酰葡萄糖胺（N⁃acetyl⁃glucosamine，GlcNAc）结构降低，Smad3和Erk1/2的磷酸化上调，最终导致了肝细胞癌的EMT［13］。Pinho等［14］发现，MGAT3和GnT Ⅲ介导的E⁃cadherin的N⁃糖基化丢失是EMT 的机制，在EMT 过程中，MGAT3的表达显著降低。在宫颈癌中，MGAT3的过度表达导致上皮分化标志物E⁃cadherin 的表达增加，间充质标志物N⁃cadherin 和β⁃catenin 的表达降低，从而抑制了宫颈癌细胞转移［15］。乳腺癌细胞中MGAT3的过度表达抑制了细胞迁移、增殖、集落形成、EMT标志物的表达和AKT信号通路［16］。另外，miR⁃199a⁃5p也在如卵巢癌、乳腺癌、喉癌、口腔鳞癌、甲状腺癌、结直肠癌、侵袭性膀胱癌等多种恶性肿瘤中表现出了抑制EMT 的作用［17-23］。但在另外一些如肝细胞癌、胃癌、宫颈癌及前列腺癌等肿瘤中却也可促进肿瘤细胞EMT的过程［24-27］。

虽然目前已有许多研究证实miR⁃199a⁃5p 和MGAT3 这两种生物标志物在肿瘤细胞EMT 过程中发挥了不可或缺的作用，但其是否参与CARAS 的EMT 过程，从而影响患者气道重塑过程尚未明确。而且对于circ_0070934 的研究较少，目前只知它参与了皮肤鳞状细胞癌的侵袭和增殖［28］，但具体机制尚不清楚。探索circ_0070934/miR⁃199a⁃5p/MGAT3在CARAS EMT 中的作用和机制将成为下一步研究的目标，这对于发现CARAS新的治疗靶点有着重要意义。

慢性鼻窦炎伴鼻息肉（chronic rhinosinusitis with nasal polyps，CRSwNP）常与支气管哮喘和鼻炎共存［29］。研究表明，哮喘使鼻息肉的风险增加了3.5倍，过敏性鼻炎则使患鼻息肉的风险增加2.5 倍［30］。轻度和中度哮喘患者的鼻息肉患病率分别为4.8%和9.6%，而重症哮喘患者达到44.6%［31］。鼻息肉和哮喘共病（nasal polyps and comorbid asthma，NPCA）的患者有两种不同的炎症表型：嗜酸性和非嗜酸性，并且上下气道的炎症类型一致。与非嗜酸性NPCA 患者相比，嗜酸性NPCA 患者哮喘表型更严重，FeNO和IgE水平更高，血EOS增多，药物治疗后鼻息肉复发率也增加［32］。伴有CRSwNP的重症哮喘通常是一种高EOS 类型，其特征是2 型固有淋巴细胞（innate lymphoid cells，ILC2）激活，释放IL⁃5和IL⁃13，以及相对少量的IL⁃4［33］。这些细胞因子通过趋化EOS，促进气道炎症细胞浸润［34-36］。另一项研究也发现，EOS计数和FeNO水平低的重症哮喘患者鼻息肉的发生率显著低于数值较高者，EOS 计数大于420 个/μL 和FeNO 水平≥39 ppb 是重症哮喘伴随鼻息肉的最佳预测因子［37］。鼻息肉的存在与哮喘患者的肺功能FEV1的加速下降显著相关［38］。因此，鼻息肉的存在对哮喘患者的症状、表型、类型、严重度及预后都有着显著影响，呼吸道过敏性疾病与鼻息肉同时存在无疑会加重炎症过程，使治疗受阻并复杂化，增加复发率。本研究并没有纳入鼻息肉，鉴于鼻息肉的存在与EOS 和FeNO 有正相关性，而本研究发现circ_0070934/miR⁃199a⁃5p/MGAT3 与EOS和FeNO 有相关性，因此合理猜测circ_0070934/miR⁃199a⁃5p/MGAT3与鼻息肉也存在某种联系，其具体作用机制值得进一步研究探讨。

综上所述，本研究发现circ_0070934/miR⁃199a⁃5p/MGAT3 可以作为CARAS 诊断的生物标志物。CARAS的发生发展机制仍有许多未明晰的地方，本研究仅挑选circ_0070934/miR⁃199a⁃5p/MGAT3作为切入点探索这些指标在CARAS 患者外周血中的表达水平及其意义，其具体作用机制需进一步深入研究，为CARAS的早期诊断和治疗提供更多思路和理论支持。