RP-HPLC法同步定量桦木脑、桦木酸、齐墩果酸和熊果酸及其在连翘检测中的应用

邹盛勤，梅应轩，陈 琴，翁绍圳，杜裕华

(1.宜春学院 化学与生物工程学院，江西 宜春 336000；2.江西省天然药物活性成分研究重点实验室，江西 宜春 336000；3.宜春职业技术学院 医学基础部，江西 宜春 336000)

中药是中华民族的瑰宝，在控制和治疗非典型性肺炎(SARS)、新型冠状肺炎疫情中均发挥了很好的作用，而由中药连翘为组方的连花清瘟和金花清感就是其中具有代表性的良方。连翘(Forsythiasuspensa)是木犀科连翘属植物，其药用部位为干燥的果实，[1]有疏风热、消散结、清热解毒等诸多功效，临床上经常用于治疗痈肿疮毒、风热感冒等病症。[2-3]连花清瘟处方由连翘、金银花、广藿香和鱼腥草等13味中药组成。[4]金花清感由银翘散和麻杏石甘汤化裁制成。[5-6]连翘中主要含有有苯乙醇苷类、木脂素类、三萜类、黄酮类、有机酸类、酚类、醌类等化学成分。[7-8]已知连翘的药理学活性主要体现在抗细菌、抗肿瘤、抗炎、抗氧化等方面。[1]胡金婉等[9]采用HPLC法测定了13批连翘中芦丁、连翘酯苷A、连翘苷、齐墩果酸和熊果酸5种主要活性成分的含量，并对测定结果进行了聚类分析，证实不同产地或同一产地青翘老翘中主要活性成分的含量存在差异。郭婷等[10]采用乙醇冷浸，乙酸乙酯萃取，柱色谱分离了乙酸乙酯部位化学成分，鉴定出白桦脂酸、熊果酸、齐墩果酸和methyl-3α-hydroxyolean-18-ene-28-oate等4个三萜类化合物。李晓[11]等采用乙醇提取，活性炭脱色，大孔树脂富集，从连翘叶中分离纯化得到了纯度可达96%的熊果酸，方法得率较高。连花清瘟等处方中多味中药均含有三萜类成分，而同时定量分析连翘中三萜类4组分桦木脑(Betulin，Bet)、桦木酸(Betulinic acid，BA)、齐墩果酸(Oleanolic acid，OA)和熊果酸(Ursolic acid，UA)鲜见报道。本实验采用RP-HPLC法对连翘中Bet、BA、OA和UA进行了含量测定，为连翘中三萜类药效成分的定量分析和含量比较提供了有效的方法。

1 材料

1.1 仪器

Waters高效液相色谱仪(515泵，2996检测器，Empower工作站)；HP-DR05高纯水机(上海广创通用设备有限公司)；CP225D准微量天平(德国赛多利斯公司)；超声波清洗器(江西华特精密仪器有限公司)。

1.2 试药

甲醇为色谱纯(J&K SCIENTIFIC LTD.)，水为超纯水。白桦脂醇对照品(批号B129169，阿拉丁)，白桦脂酸对照品(批号10039-200812，南昌贝塔生物科技有限公司)，齐墩果酸对照品(批号110709-201106，中国食品药品检定研究院)，熊果酸对照品(批号110742-201304，中国食品药品检定研究院)。连翘药材经鉴定为木犀科连翘属植物连翘(Forsythiasuspensa)的干果。

2 方法与结果

2.1 色谱条件及对照品出峰时间

采用C18RP色谱柱；流动相为甲醇∶水=87∶13，流动相的流速为0.6mL·min-1，检测波长210nm，手动进样，色谱柱的柱温30℃，记录的HPLC图谱如图1、图2所示。4种三萜类成分分离良好，分离度均大于1.5，且色谱峰峰形对称。

图1 混合对照品色谱图

图2 连翘样品色谱图

2.2 检测波长选择

分别吸取适量制备好的混合对照品溶液和样品溶液，按照上述的色谱条件进行进样分析检测，在180～500nm波长范围内扫描的紫外吸收，得到设定波长范围内的紫外吸收曲线(图3)。因考虑到需同时检测4个三萜类成分，根据吸收曲线显示，在210nm处4种成分的吸收峰能信噪比较好，所以选择210.0nm作为本实验的检测波长。

图3 对照品的紫外吸收光谱

2.3 溶液制备

2.3.1 混合对照品溶液的制备

用电子天平精密称量对照品Bet4.71mg、BA4.36mg、OA3.34mg和UA4.91mg，放入5mL的容量瓶中，加入95%乙醇定容至刻度线，摇晃混匀。得到Bet的质量浓度为0.942mg/mL，BA的质量浓度为0.872mg/mL，OA的质量浓度为0.668mg/mL，UA的质量浓度为0.982mg/mL的标准样品溶液。

2.3.2 待测样品溶液的制备

将4种连翘样品放入烘箱中60℃中烘干5h，取出冷却后用粉碎机磨成粉末，用电子天平分别称取四川青翘2.5029g，四川老翘2.4935g，秦岭青翘2.5601g，秦岭老翘2.4971g，将样品放入锥形瓶，准确量取50mL的95%的乙醇加入再混合均匀，超声波提取30min，超声后冷却后用0.45μm滤膜过滤，装入进样瓶中得到样品溶液。

2.4 方法学实验

2.4.1 线性关系考察

向高效液相色谱仪中手动进样1μl、5μl、10μl、15μl、20μl、25μl上述配制的对照品溶液，用上述色谱条件进样测定样品的吸收峰面积，以混合对照品质量浓度为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)，分别绘制出标准曲线，得到回归方程、线性相关系数(r)和线性范围。[12]见表1。

表1 回归方程与线性关系

2.4.2 系统适用性考察

将上述的混合对照品溶液、样品溶液及加样回收溶液按照上述的色谱条件进样，每次5μl，然后计算进样试液中Bet、BA、OA、UA所对应的吸收峰面积，计算出峰面积或含量RSD。由数据分析可以得知，检测仪器的精密度、重复性和加样回收率均符合定量分析要求(表2)。

表2 方法适应性考察(%)

2.4.3 样品含量测定

精密进样5μl上述制备的连翘样品溶液，使用相同的色谱条件测定连翘样品溶液中Bet、BA、OA和UA的吸收峰面积，然后计算出各个成分的含量。见表3。

表3 连翘样品测定结果(%)

3 讨论

连翘中三萜类4组分因产地和采摘时间不同而含量有些不同。[13]秦岭的青翘三萜类4组分含量高于四川青翘；秦岭老翘与四川老翘相比Bet、BA含量高，UA、OA的含量低，特别是UA含量相差很大。秦岭青翘与老翘相比Bet、OA含量高，BA、UA含量低。四川产青翘和老翘相比BA、OA、UA含量低，而青翘中Bet含量未检出。建立的RP-HPLC法能有效分离极性相近的三帖类成分，分离度适合定量分析要求，且通过紫外光谱识别可增强方法的定性分析能力，适用于中药连翘中三萜类成分的分析。

曹冉冉[14]等学者研究了不同连翘的有效成分含量，结果表现是青翘的有效成分含量普遍高于老翘，而传统观念上认为老翘的药效即药品质量要高于青翘，可能产地不同各有差异。但老翘在临床的应用更加广泛，影响这两者区别的具体原因还未知，化学成分的稳定性等方面是否影响了连翘的药效，这些问题还有待进一步考证。