细胞衰老检测指标及衰老模型研究进展

张凌云,刘 缨

(北京中医药大学生命科学学院,中国北京 102488)

细胞衰老(cellular senescence,CS)是细胞增殖、分化能力和生理功能逐渐发生衰退的变化过程[1～2]。细胞衰老研究是衰老机制、抗衰老、抗癌[3]研究的重要内容之一,而构建细胞的衰老模型是研究细胞衰老必不可少的步骤。根据诱发因素的不同,细胞衰老可以划分成应激诱导早衰(stress-induced premature senescence,SIPS)、复制性衰老(replicative senescence,RS)[4～5]、癌基因诱导衰老(oncogene-induced senescence,OIS)。

衰老指标对于验证所制备模型成功与否十分重要,指标的选择也同样重要。目前,不同文献中使用的衰老细胞模型和检测指标都不尽相同。不同情况下如何选用合适的模型和检测指标尚无统一标准。本文讨论和分析了现有的一些细胞衰老模型的建立方法,列举了常用的细胞衰老检测指标并总结了其选择方法,以便为相关的研究提供参考。

1 检测指标

细胞衰老的特征包括细胞形态变化、细胞周期阻滞、氧化应激水平和染色质的改变。由于没有单一的性状可以独自定义细胞衰老,所以体外衰老表型的确定往往需要多个特征同时验证,有文献建议至少验证3个不同的特征[6]。具体的检测指标有基于这些特征的通用指标,如:衰老相关的β-半乳糖苷酶(senescence-associated beta-galactosidase,SA-β-Gal)活性升高、细胞形态改变、衰老相关蛋白质累积、细胞周期分布改变、DNA损伤灶产生[7]、衰老相关的分泌表型(senescence-associated secretory phenotype,SASP)[1,8]等;也有基于不同诱导剂以及细胞类型的特异指标,如:造血祖细胞混合细胞集落形成单位(colony forming unitmix,CFU-mix)、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)、ATP的合成及线粒体的膜电位。

1.1 形态变化相关指标

1.1.1 衰老相关的β-半乳糖苷酶活性

SA-β-Gal活性升高被一致认为是评价细胞衰老的生物学标志。目前,绝大部分关于细胞衰老模型的文献都有使用SA-β-Gal染色法对其活性进行检测,只有少数例外[9]。这也是唯一可以将不同文献中所建立的模型进行对比的指标。Dimri等[4]首次证明,该生物标志物在生物体内随着细胞的衰老而逐渐积累增多。β-Gal是一种水解酶,其在衰老前细胞、静止细胞和终末分化细胞中是缺乏的,只有在衰老细胞中才可以催化β-半乳糖苷水解为单糖[4,6,10]。在pH为6.0的条件下进行β-Gal测定时,只有处于衰老状态的细胞才会出现由人工显色底物X-Gal(5-溴-4氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)分解产生的蓝色染色沉淀物。该现象是由于内源性溶酶体β-Gal特异性地在衰老细胞中的过度表达和积累,可以很容易并且可靠地在原位和体外被检测到[4,11]。用光学显微镜进行观察并且计数时,表达蓝色的细胞即为β-Gal阳性,细胞阳性染色百分率可以表示群体衰老程度。

1.1.2 细胞形态变化

衰老细胞的形态特征是体积增大,生长在固体表面时明显扁平,细胞核增大且形状不规则。这些特征观察起来很方便,部分文献选择细胞形态作为细胞衰老的检查指标[12],但是没有一个量化标准。McKenna等[13]根据细胞形态的特征变化,利用细胞核染料4＇,6-二脒基-2-苯基吲哚(4＇,6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)标记核DNA,以生长细胞扁平化时DNA相关的部分区域荧光强度与细胞核面积比值的下降,作为衰老的一个形态计量指标。核纤层蛋白B1(lamin B1)是维持细胞核结构完整性的关键,其减少导致核完整性和稳定性下降,继而导致其他核变化[6,14],这种减少可以通过成像或免疫印迹检测,从而指示体外衰老表型[6,15]。

1.1.3 衰老相关的分泌表型

衰老的发生经常与持续性的DNA损伤反应(DNA damage response,DDR)有关[15],同时伴随着细胞分泌功能增加,即衰老相关分泌表型(SASP)。SASP因子的种类复杂多样,主要有促炎因子、生长因子、趋化因子等[16]。复制性衰老与诱导型衰老有相类似的表型,它们都会引起相关炎症因子的释放,出现SASP。促炎因子是SASP的重要组成部分之一,是衰老细胞的关键特征[17]。另外,白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)和IL-8在衰老细胞中表达上调,也是细胞衰老的重要指标。IL-8是C-X-C趋化因子家族的一员,在细胞凋亡中发挥着重要作用[17]。

1.2 细胞周期相关指标

1.2.1 衰老相关细胞周期蛋白

周期蛋白依赖性激酶抑制物(cyclin-dependent kinase inhibitor,CKI)是一种调节细胞增殖的重要信号分子,其中最具代表性的是P16、P21和P53[17]。P21、P53、P16的表达上调可促进细胞衰老发生[18～19]。细胞衰老的一个主要特征是不可逆转的细胞生长周期停滞,这主要是由于P16/RB和P53/P21通路的调节,这两条通路的调节和变化也是导致细胞衰老的两种理论信号转导机制[20]。P16INK4a、P21-Cip1是认可度较高的衰老相关标志物。P21能够普遍结合进而阻碍各类周期蛋白依赖性激酶(cyclin-dependent kinase,CDK)复合物的生成,降低RB的磷酸化水平,抑制E2F的释放,阻碍DNA的生成,进而致使细胞无法进入S期,只能停滞在G1期,最终诱发细胞衰老[21]。p53基因是一种与细胞生长、凋亡、衰老和DNA修复相关的重要基因。有研究指出,降低p53基因的表达水平可以减少皮肤细胞凋亡,并且能够一定程度缓解皮肤衰老[22～23]。p53同时也是一种抑癌基因,其编码的蛋白质P53参与细胞对DNA损伤的应答,具有促进或抑制衰老的双重作用[4,24]。

1.2.2 细胞周期分布

细胞周期是指连续分裂的细胞从一次分裂完成时开始到下一次分裂完成时为止的过程。细胞周期调控细胞衰老,G1/G0期的永久性细胞周期停滞是细胞衰老的特征之一,此种停滞由每个细胞的DNA数量决定。相较于年轻细胞,衰老细胞中处于S期的细胞进一步减少,G1/G0比值下降,G2/M比值增加[25]。因此,细胞周期各期的分布情况也可用于监测衰老,其常采用流式细胞术或碘化丙啶(propidium iodide,PI)染色法进行分析。

1.3 细胞抗氧化能力检测指标

自由基所导致的氧化损伤是细胞衰老的几大学说之一。机体的抗氧化能力与衰老密切相关,当机体受到压力刺激或抗氧化能力减弱时,过量的活性氧(reactive oxygen species,ROS)在体内堆积,导致氧化损伤,从而引发衰老及相关疾病[26]。衰老往往伴随着抗氧化能力的下降,因此抗氧化因子的表达和活力也是常用的衰老指标。如:超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)是清除ROS的关键酶,可以将毒性超氧化物转化为过氧化氢和水[20]。SOD是机体抗氧化系统的重要组成部分,也是机体抗氧化能力的重要评价指标。

长寿基因Sirt1(sirtuin1)表达的去乙酰化酶可抑制p53基因表达,延缓细胞的凋亡和衰老[27～28]。该因子在线粒体调控及清除ROS的过程中也起到关键作用,可通过抑制核转录因子κB(nuclear transcription factor-κB,NF-κB)通路降低细胞内ROS的水平,进而延缓细胞的衰老进程[19]。NF-κB是一种和衰老有密切关联的调控因子,其过表达可以引起所培养的细胞出现衰老表型[19]。丙二醛(malondialdehyde,MDA)是膜脂过氧化的重要产物之一,其水平能够反映出机体内脂质过氧化的程度,从而间接说明细胞受到伤害的程度。由于ROS的产生和线粒体有关,所以线粒体膜电位水平也能够在一定程度上说明机体的氧化损伤程度[29]。因此,NF-κB、MDA和线粒体膜电位均可作为机体抗氧化能力降低的间接检测指标。

1.4 染色质改变相关指标

1.4.1 DNA损伤灶

除了显著的形态学改变、SA-β-Gal活性升高,与衰老相关的异染色质灶(senescence-associated heterochromatin foci,SAHF)是衰老细胞的另一个典型特征[15],组蛋白H3第9位赖氨酸三甲基化(H3 lysine 9 trimethylation,H3K9me3)、异染色质蛋白 1γ(heterochromatin associated protein 1γ,HP1γ)是其标志蛋白质[30～31]。DNA是组成染色质的主要成分。DNA损伤中最严重的形式为DNA双链断裂,其应用最广泛的标记物是γ-H2AX(phosphorylated histone H2AX)。

1.4.2 DNA甲基化

部分DNA甲基化数据已被开发为衰老的生物标志物,即“表观遗传时钟”,其已被广泛用于识别健康和疾病(包括认知功能衰退和其他神经退行性变性疾病)的实际年龄与生物年龄之间的差异,是目前最具前景的衰老生物标志物之一[32]。DNA甲基化时钟包括特定的一组由嘧啶-磷酸-鸟嘌呤二核苷酸组成的DNA甲基化位点,其甲基化状态可用于测量主观年龄,即生物衰老程度。这些时钟被认为是人类和其他脊椎动物按时间顺序年龄的准确生物标记,可以量化生物衰老的速度[33]。

近期,Liu等[34]首次从多角度对11个当前的DNA甲基化时钟进行了比对分析,并建立了新的组合式DNA甲基化时钟“meta-clock”,其在反映衰老特征方面更为高效,而且可以区别肿瘤与正常组织,可以更好地进行全因死亡预测。这类组合式时钟的探索,或许将有利于开发出更有效可靠的衰老生物标志物用于临床及转化研究。

1.5 特异指标的选择

1.5.1 和细胞的类型有关

衰老指标的选择和细胞类型相关,因为不同细胞有其特异的衰老表现。例如,干细胞的自我更新能力会随着机体年龄的增加而不断下降,部分研究者会利用细胞增殖能力检测方法,如CCK8、Ki67免疫荧光染色[35～36],辅助干细胞衰老鉴定。当然,增殖能力不仅仅是干细胞才有,一些增殖能力较强的细胞模型在衰老鉴定的时候也会用到增殖检测,如大鼠髓核细胞(nucleus pulposus,NP)[35]、乳腺癌细胞[36]。对于造血干细胞(hematopoietic stem cell,HSC)和祖细胞(hematopoietic progenitor cell,HPC),集落形成单位(colony-forming unit,CFU)是评价其自我更新能力以及多向分化潜能的重要指标[37～38],有研究选用CFU-mix作为多向HSC的衰老评价指标[38]。碱性磷酸酶(ALP)高表达是牙囊细胞(dental follicle cell,DFC)早期分化的重要指标[39],也可作为其衰老检测指标。纤溶酶原激活物抑制剂-1(plasminogen activator inhibitor 1,PAI-1)是一类有效的纤溶抑制剂和血栓形成的介质,其表达可以作为人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cell,HUVEC)衰老的标志物[40]。另外,相关研究在对人真皮成纤维细胞(human dermal fibroblast,HDF)进行研究时,将Ⅰ型胶原蛋白(collagen typeⅠ,Col-Ⅰ)和基质金属蛋白酶-1(matrix metalloproteinase 1,MMP-1)纳入检测指标[9]。表1给出了部分衰老指标在不同细胞相关研究中的选用情况[9,30,35,37,39～41]。

表1 衰老指标在不同细胞中的应用Table 1 Hallmarks of senescence applied for different cells

1.5.2 和诱导剂的种类有关

衰老指标的选择还和诱导剂的种类有关。例如:使用H2O2作为诱导剂的时候,由于H2O2通过氧化应激的方式,最终引起DNA的损伤,激活P53/P21信号通路,所以研究人员往往会将DNA损伤标志物γ-H2AX或者P21等衰老相关蛋白质加入检测指标[42～43];选用血管紧张素Ⅱ(angio-tensinⅡ,AngⅡ)作为诱导剂对人血管平滑肌细胞(human vascular smooth muscle cell,hVSMC)进行研究时,因AngⅡ可以通过端粒依赖性和非依赖性途径介导DNA氧化损伤,从而加速血管平滑肌细胞的衰老,所以研究人员将DNA损伤、端粒DNA长度纳入其检测指标[44]。AngⅡ还可以刺激NADPH氧化酶1(NADPH oxidase 1,Nox1)激活,并通过降低过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活因子1α(peroxisome proliferator-activated receptor-γcoactivator-1α,PGC-1α)活性、增加线粒体氧化应激等途径,介导线粒体功能障碍,导致血管平滑肌细胞的衰老,因此,Tsai等[29]将ATP的合成及线粒体的膜电位也用于衰老判定。

1.5.3 和研究目的有关

衰老指标的选择也和研究目的有关。自噬途径具有消除受损蛋白质和细胞器进而延长寿命的功能,衰老的细胞往往伴随自噬活性的下降。有研究发现,自噬通过消除损伤细胞器、减轻氧化应激、促进胞内物质循环等途径,保护血管内皮细胞,避免其死亡[45]。Wang等[46]在研究虫草素对衰老的抑制作用与自噬途径的相关性中,就将细胞自噬水平相关蛋白质P62、微管相关蛋白轻链3B(microtubule associated protein 1 light chain 3B,LC3B)纳入检测指标。

2 细胞衰老模型

无论是通用或者非通用检测指标的选择,其目的都是对细胞衰老进行更深入的研究。人为构建的细胞衰老模型根据诱发因素的不同,可以划分成应激诱导早衰、复制性衰老以及癌基因诱导衰老。

2.1 复制型

复制性衰老是端粒在每次分裂结束时逐渐侵蚀的结果,直至细胞达到端粒功能障碍的状态(称为Hayflick的极限)[47]。复制性衰老模型是基于器官老化内在机制的常用实验性衰老模型[48]。复制性衰老模型的构建一般不使用药物,这避免了与后期实验组进行药物处理时发生冲突,因此模型适用范围更广。但是,其造模往往需要多次反复传代,耗费的时间和人力较大[49]。

当前,多种细胞被用于复制性衰老研究。例如:王晓睿[49]对鼠肾小管原代上皮细胞进行传代培养,13 d后衰老比率超过95%;Han等[50]研究了自噬在复制衰老过程中的可能作用,发现基础自噬水平降低可能是人类包皮成纤维细胞Hs68复制性衰老的机制;Delfarah等[51]基于液相色谱-质谱联用(liquid chromatography-mass spectroscopy,LC-MS)的代谢组学,研究了衰老的原代人乳腺上皮细胞(human mammary epithelial cell,HMEC),发现抑制核苷酸合成促进HMEC的复制衰老;Gao等[52]利用人胚肺二倍体成纤维细胞(human embryonic lung diploid fibroblasts)2BS和人胚肺成纤维细胞(human fetal lung fibroblasts)WI-38证明,E2F1介导复制衰老过程中POLD1[polymerase(DNA)delta 1]的下调。

2.2 诱导型

诱导型衰老模型(SIPS)与复制型不同,其构建有H2O2、辐射、高糖、药物等多种诱导方式,其中H2O2是最常用的诱导剂,通常可以在几天之内完成衰老模型的构建,并且对多种细胞都有效[49]。

2.2.1 H2O2诱导

氧化损伤是现今较为常见的细胞衰老模型构建原理。H2O2通过氧化应激的方式,最终引起DNA的损伤,激活P53/P21信号通路[53]。H2O2诱导条件基于实验目的和细胞类型的不同而调整。Marazita等[43]建立了H2O2诱导的ARPE-19细胞衰老模型,其将细胞暴露于150 mmol/L H2O290 min,维持培养基培养10 d后,阳染率有80%。Lim等[54]用1 mmol/L H2O2处理人骨骼肌成肌细胞(CHQ5B)30 min,探讨富托三烯酚组分(tocotrienol-rich fraction,TRF)对其衰老的调控作用。苏慧丽等[55]选择人胚肺二倍体成纤维细胞系2BS制备衰老模型,200 μmol/L H2O2处理2 h后,培养5 d,阳染率接近95%。

三丁基过氧化氢(tert-butyl hydroperoxide,t-BHP)也被用作制备细胞氧化损伤模型的诱导剂。Zhou等[38]报道,t-BHP可致小鼠造血干细胞(HSC)衰老,其诱导培养6 h后细胞的衰老阳染率达到57.92%±4.24%。

2.2.2 辐射诱导

辐射诱导对环境的要求较高,并且需要更加精密的分析仪器[49]。衰老的主流观点认为,DNA损伤积累最终导致机体衰老,而电离辐射可以使DNA的双链断裂继而致使DNA损伤。

Dalle Pezze等[56]设计了一个数学模型来模拟20 Gy X射线照射5 min诱导细胞衰老的动态过程。模型整合了细胞老化的5个关键调控因素:胰岛素受体、FoxO3a(forkhead box protein O 3a)、DDR、ROS和线粒体功能。其优点是可以随时对模型进行调整,且快速;缺点是对于未弄清楚机制的衰老调节通路,无法复制进模型中。Schick等[57]联合应用放射疗法(radiotherapy,RT)与曲美替尼,探索曲美替尼使RAS/RAF突变黑色素瘤细胞放射增敏的机制。McRobb等[41]用20 Gy剂量的辐射诱导小鼠脑微血管内皮细胞(brain-derived endothelial cells.3,bEnd.3)衰老,发现第6天时阳染率达到65%±8%。此外,也有文献使用311 nm紫外线(UVB)诱导HDF细胞衰老,结果显示细胞阳染率可达到90%左右[58]。

2.2.3 高糖诱导

在诱导细胞衰老中,D-半乳糖是被使用得较多的糖类诱导剂[9]。D-半乳糖在正常情况下可经肝脏代谢成葡萄糖,但在较高浓度时,D-半乳糖在醛糖还原酶的催化下还原成半乳糖醇[42],后者的积累导致细胞渗透压变化、细胞肿胀、膜脂损伤等衰老表现。D-半乳糖诱导的细胞损伤可以触发ROS的生成[59],导致脑神经退化。此外,D-半乳糖可以诱发蛋白质糖基化反应,最终形成晚期糖基化终末产物(advanced glycation end product,AGE)[60],AGE聚集是许多年龄相关退行性疾病的常见特征[59]。目前,高糖与衰老之间的关系仍未完全阐明。

除了D-半乳糖,脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)、葡萄糖等也可用于诱导细胞衰老。Hou等[35]用浓度为0.2 mol/L的葡萄糖诱导大鼠髓核(NP)细胞衰老。刘印康等[9]用脂多糖诱导HDF细胞衰老。最近,缺乏核型营养不良聚糖(β-DG)使小鼠成肌细胞(C2C12)获得衰老特征被证实[61]。除此之外,人们在糖尿病机制研究中也发现,通过上调血小板反应蛋白CD47依赖性信号通路可以妨碍血管生成并诱导内皮细胞衰老[62]。有报道显示,核糖也可用来诱导构建衰老相关疾病模型[63～64]。

2.2.4 其他药物诱导

Herbert等[44]用AngⅡ诱导hVSMC的衰老,验证了AngⅡ通过ROS介导的DNA损伤致使hVSMC衰老的假说。Tsai等[29]则在该模型的基础上对衰老的机制开展了进一步研究。

由于研究细胞衰老对抗肿瘤具有积极的作用,所以部分研究人员致力于抗肿瘤药物在细胞衰老中的作用机制研究。Ota等[40]用抗肿瘤药物诱导HUVEC细胞衰老,并发现西罗莫司和依维莫司诱发的内皮细胞衰老是Sirt1依赖性的,而紫杉醇通过Sirt1非依赖性途径发挥作用。Demaria等[65]发现,阿霉素(doxorubicin,Doxo)等4种常用的化疗药物可以诱导正常非癌组织中衰老细胞的持续存在。Liu等[66]发现,异染色质组织在Doxo或H2O2诱导人脐带间充质干细胞衰老的早期阶段被激发。另有研究表明,免疫抑制剂及抗癌药物雷帕霉素可以预防细胞和组织的衰老[37],由此其被视为潜在的抗衰老药物受到进一步关注。

2.3 癌基因诱导衰老

除了复制性衰老、应激性早衰,癌基因诱导衰老也是细胞衰老的一大类型。癌基因通过调节某些基因诱导细胞衰老[67]。Paget等[36]通过敲除PKCi基因研究了其对乳腺癌细胞衰老的抑制作用。Nojima等[68]通过敲除SPT6基因诱导细胞衰老。Crochemore等[69]通过敲除Cockayne综合征(Cockayne syndrome,CS)相关基因CSB诱导p21依赖性早衰,揭示了CSB的缺失是基于p21的复制性衰老的已知最早的触发因素。

3 总结

复制性衰老模型不使用药物,避免了药物之间的相互作用,更符合真实衰老状态。但是其缺点也很明显,即模型制作耗时长,在实验中会消耗更多的人力以及物力。诱导型衰老模型则相反,造模时间稍短,一般在5～8 d即可造模成功。但是其缺点也不容忽视,如诱导剂的使用对于后续的实验可能会有未知的影响。另外,就不同诱导剂造模成功率来看,H2O2能达到一个较高的衰老率(平均80%以上),糖类较低,其他诱导剂则参差不齐。就辐射诱导而言,其对所需仪器的要求较高,且诱导方向的不确定性较大。而无论是药物诱导还是辐射诱导或者是基因调控诱导,都会对细胞产生一种损伤性的影响。因为这种损伤造成的快速衰老现象在细胞的自然衰老过程中一般不会出现或者出现较少,所以诱导型的衰老模型和自然衰老模型可能仍然存在一定的差异。如果能够在制作模型的时候和自然衰老模型进行实时比较,或许能校准这种可能存在的差异。

细胞衰老模型是否成功建立最终还要依靠检测指标证实。检测指标的选择不仅限于衰老标志物,还和所选用的细胞类型、诱导剂的种类以及实验最终的研究目的有关。选择适当的模型和检测指标,是正确分析和评价实验结果的前提。对衰老检测指标和细胞模型的研究将进一步为相关的科学研究提供材料和基础数据。

致谢:十分感谢实验室的係梦琪师姐给予文字部分的指导并且协助完成论文修改工作。