GABAB受体激动剂巴氯芬对小鼠空间识别记忆能力的影响

周 正,宋美慧,褚光辉,付 玉

(昆明理工大学医学院,中国云南 昆明 650500)

巴氯芬(baclofen)是γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)的一种衍生物,在临床上具有广泛的用途。首先,巴氯芬可用作抗痉挛剂和中枢肌肉松弛剂[1～2]。其次,巴氯芬具有镇静、镇痛作用[3]。此外,巴氯芬还可用于治疗酒精或药物成瘾等[4～5],并且在治疗精神分裂症、抑郁症、癫痫和阿尔茨海默病等精神或神经疾病中具有一定的潜在用途[6～8]。

巴氯芬是迄今为止临床上唯一使用的γ-氨基丁酸 B 型(γ-aminobutyric acid type B,GABAB)受体激动剂[9]。GABAB受体在认知神经系统中具有重要作用。在GABAB受体分布层面,其在中枢神经系统中广泛分布,在参与空间学习记忆的海马脑区更是有较高的表达[3]。在GABAB受体功能层面,其神经活动与学习记忆、奖励、应激和焦虑等功能相关[3,10～12],同时参与大量神经系统和功能方面的调节,包括神经递质传递系统、传导途径、记忆和其他认知功能等[10]。此外,GABAB受体还可以作为药物成瘾的潜在治疗靶标[13]。在GABAB受体的激动剂和拮抗剂层面,其激动剂能够改善酒精依赖导致的工作记忆障碍[14],其拮抗剂能够改善各种不同感知任务的行为表现,如海马依赖性的空间学习和记忆等[15]。

关于巴氯芬对认知的影响目前已有一些研究,但结果尚存争议。首先,已有报道发现巴氯芬能够改善认知能力。例如,巴氯芬激活GABAB受体能够改善应激状态下的空间记忆障碍[16],同时还能够改善运动障碍和认知能力[17]。其次,也有报道认为巴氯芬对认知功能无影响。例如,长时程高剂量注射巴氯芬能够短暂降低记忆能力,但不影响空间学习能力[9],也不影响参考和工作记忆。此外,还有研究发现巴氯芬能够剂量依赖性地损伤空间学习能力[18～20]。这些差异性的研究结果可能来源于不同的药物注射剂量、药物在行为测试前的注射时间,以及不同的实验研究范式,如水迷宫和高架迷宫涉及惩罚、八臂迷宫涉及食物奖励因素等。

探索型Y迷宫是一种检测动物空间识别记忆能力的实验范式[21～22]。该迷宫是基于啮齿类动物探索新异环境的天性设计的,避免了奖赏和惩罚对小鼠行为表现的影响。Y迷宫能够在不需要学习规则的状态下测量动物的空间识别记忆能力。在该任务中,训练阶段开放两个臂,关闭第3个臂,仅让动物探索开放的两个臂;测试阶段则同时开放3个臂,动物可以在3个臂内自由探索。实验完成后,研究者通过比较动物对3个臂的探索程度来分析其对新异度与熟悉度的区别。

本研究旨在探讨巴氯芬在不同剂量下对小鼠空间识别记忆能力的影响。通过旷场实验和Y迷宫实验,我们发现高剂量巴氯芬能够损伤小鼠的运动能力及探索能力,并且巴氯芬能够剂量依赖性地损伤小鼠的空间识别记忆能力。

1 材料与方法

1.1 实验动物

实验小鼠引进于成都达硕实验动物有限公司,均为成年C57BL/6雄性小鼠,体重为25～35 g,共47只。小鼠饲养于33 cm×20 cm×14 cm(长×宽×高)的饲养笼中,每笼5～6只。小鼠在自然昼夜节律下,以自由饮食状态饲养,饲养室恒定温度为23～25℃。所有实验动物的操作均符合中华人民共和国《实验动物管理条例》相关规定。

1.2 药物注射处理及动物分组

巴氯芬(美国Sigma-Aldrich公司)用0.9%的生理盐水(山东康宁药业有限公司)溶解。在已有的巴氯芬相关研究中,1.0 mg/kg被认为是相对较低剂量[18],6.0～10.0 mg/kg则被认为是高剂量[16],因此本实验选取1.0 mg/kg、2.5 mg/kg和7.5 mg/kg分别对应为低、中、高剂量组。实验组小鼠分别腹腔注射低、中、高剂量的巴氯芬,对照组小鼠则注射0.9%生理盐水,注射体积均为0.01 mL/g。

在首先进行的旷场实验中,小鼠随机分为4组(1个对照组、3个实验组),每组11～12只。所有小鼠按照既定分组在实验前30 min给药。旷场实验结束至少1周以后进行Y迷宫实验。在Y迷宫实验中,所有小鼠重新随机分组,并于Y迷宫实验前30 min给药。根据文献报告,巴氯芬的半衰期约为5 h[23],因此在本研究中旷场实验和Y迷宫实验至少间隔1周,以确保巴氯芬的完全代谢。

1.3 旷场实验

旷场实验是用于检测小鼠在新异环境中的探索能力、运动能力及焦虑程度的行为学方法。本实验所使用的旷场实验箱为实验室自制,由40 cm×40 cm×40 cm的正方体组成,底部分为中心区和外周区两个部分,中心区大小为20 cm×20 cm,其余为外周区(图1)。位于旷场箱正上方的摄像系统用于记录小鼠在旷场内的行为学。

图1 小鼠旷场实验运动轨迹图黑色实线为小鼠运动轨迹路线,中间的方形范围为旷场中心区,其余为外周区;右下角的●为小鼠进入旷场的起始位置,另一个●为实验结束时小鼠所在位置。Fig.1 The trajectory of mice in the open field testThe black line is the path of the mouse movement.The square area in the middle represents the central area of the open field,and the rest is the peripheral area.“●”in the lower right corner is the starting position of mice when they entered the open field,and the other“●”is the ending location.

实验开始时将小鼠沿旷场箱一角面壁轻轻放入箱中,让小鼠在箱内自由活动5 min并全程进行视频采集。实验时保持环境安静、昏暗。旷场实验完成后,采用75%乙醇擦洗旷场箱,以除去气味对下一只小鼠的嗅觉干扰。

每只小鼠实验结束后统计其在5 min内的直立次数,并用软件统计分析小鼠在旷场内的总行走距离、进入中心区的次数及在中心区的停留时间等指标。

1.4 Y迷宫实验

Y迷宫实验是用于检测小鼠空间识别记忆能力的行为学方法。本实验所使用的Y迷宫设备为实验室自制,由3个臂组成,3个臂之间的夹角均为 120°,每个臂长 30 cm、宽 8 cm、高 15 cm(图2)。在中央区与3个臂相连处各有一个可移动的隔板。Y迷宫的3个臂被随机分为新异臂(novel arm)、起始臂(start arm)和其他臂(other arm)。起始臂为小鼠进入迷宫时所在的臂。实验时在迷宫底部垫有适量垫料。位于Y迷宫正上方的摄像系统用于记录小鼠在迷宫内的行为学。

实验分为训练期(图2,左)和测试期(图2,右)。训练期:开放Y迷宫的起始臂和其他臂,关闭新异臂;巴氯芬注射30 min后,小鼠由起始臂面壁放入迷宫,在起始臂和其他臂自由探索10 min。训练结束后小鼠回到原饲养笼,1 h后进入测试期。测试期:同时开放Y迷宫的新异臂、起始臂和其他臂,小鼠由起始臂面壁放入,在3个臂之间自由探索5 min。实验在安静、昏暗的环境下进行。整个实验过程使用摄像系统跟踪记录。训练期和测试期结束后分别混匀垫料,以防止气味对下一只小鼠的嗅觉产生干扰。

图2 小鼠Y迷宫实验运动轨迹图左图为Y迷宫实验训练期小鼠的运动轨迹,右图为测试期小鼠的运动轨迹。Fig.2 The trajectory of mice in the Y-maze testThe left figure shows the trajectory of mice during the training period of Y-maze experiment,and the right one shows the trajectory of mice during the test period.

实验结束后,统计分析小鼠在测试期5 min内的行走距离、穿梭次数以及在每个臂中的停留时间等指标。

1.5 统计学方法

2 结果

2.1 高剂量巴氯芬影响小鼠的运动及探索能力

首先,我们分析了小鼠在旷场中的行走距离。结果显示,巴氯芬注射显著影响小鼠在旷场中的行走距离[F(3,46)=29.26,P＜0.001]。与生理盐水对照组相比,给小鼠注射1.0 mg/kg和2.5 mg/kg剂量的巴氯芬对小鼠的行走距离没有显著影响(两者:P＞0.05),但是7.5 mg/kg剂量的药物注射显著降低了小鼠的行走距离(P＜0.001)(表1)。接下来,我们分析了小鼠在旷场中的探索次数。结果显示,巴氯芬注射显著降低小鼠的探索次数[F(3,46)=26.831,P＜0.001]。与生理盐水对照组相比,给小鼠注射1.0 mg/kg和2.5 mg/kg剂量的巴氯芬对小鼠的探索次数没有显著影响(两者:P＞0.05),但是7.5 mg/kg剂量的药物注射显著降低了小鼠的探索次数(P＜0.001)(表 1)。

表1 旷场实验结果Table 1 The results of open field test (±s)

表1 旷场实验结果Table 1 The results of open field test (±s)

注:***P＜0.001 vs.生理盐水对照组。Note:***P＜0.001 vs.the control group(0 mg/kg).

Baclofen/(mg·kg-1)0 1.0 2.5 7.5 Ambulation/cm 3 383.18±104.30 3 438.67±110.65 3 374.67±111.62 1 261.08±343.41***Rearing(time)37.09±3.09 38.00±3.69 38.92±4.09 2.83±2.57***Percentage of ambulation in center 11.95±1.43 9.99±1.20 9.82±1.15 9.95±2.73 Percentage of time in center area 11.36±1.51 9.73±1.08 9.25±1.13 6.56±2.17

此外,各剂量药物处理对小鼠在旷场中心区域的行走距离百分比和停留时间百分比没有显著影响(两者:P＞0.05),表明不同剂量的巴氯芬并未影响小鼠的焦虑程度。

2.2 巴氯芬对小鼠空间识别记忆能力的影响具有剂量依赖性

首先,我们统计分析了小鼠在新异臂的停留时间。结果显示,巴氯芬注射显著降低了小鼠在新异臂中的停留时间[F(3,46)=5.660,P=0.039]。与生理盐水对照组相比,2.5 mg/kg和7.5 mg/kg剂量组小鼠的停留时间显著降低(2.5 mg/kg,P＜0.05;7.5 mg/kg,P＜0.001),1.0 mg/kg剂量组则无显著变化(P＞0.05)(表2)。接下来,我们对小鼠在新异臂的停留时间百分比进行了分析。结果显示,药物注射组与对照组无显著差异[F(3,39)=2.319,P=0.111]。此外,当与33.3%的随机水平相比时,仅对照组在新异臂中的停留时间百分比表现出显著差异(P＜0.01)(表2)。

由于旷场实验表明巴氯芬影响小鼠的运动能力,所以我们进一步对小鼠在新异臂中的穿梭次数和行走距离的百分比与随机水平(33.3%)进行了比较。结果显示,2.5 mg/kg剂量组小鼠在新异臂中的停留时间百分比处于随机水平(P=0.941),而穿梭次数和行走距离的百分比显著大于随机水平(两者:P＜0.05);7.5 mg/kg剂量组小鼠则无论是在新异臂中的停留时间、穿梭次数,还是行走距离,都处于随机水平(三者:P＞0.05)(表2)。这些结果表明,7.5 mg/kg剂量组小鼠的空间识别记忆能力受到显著抑制,且这种抑制作用受到药物剂量的影响。

最后,为了考察小鼠在Y迷宫中的运动能力,我们统计分析了小鼠在Y迷宫3个臂中的总穿梭次数和总行走距离。结果显示:与对照组相比,2.5 mg/kg和7.5 mg/kg药物剂量均显著降低了小鼠的总穿梭次数[F(3,46)=10.904,P＜0.001;中剂量:P＜0.01,高剂量:P＜0.001](表 2);同时,7.5 mg/kg药物剂量也显著降低了小鼠的总行走距离[F(3,46)=7.770,P＜0.001;P＜0.001],但 2.5 mg/kg剂量组小鼠的总行走距离与对照组相比无显著差异(表2)。以上结果表明,7.5 mg/kg剂量组小鼠的运动能力受到抑制。

表2 Y迷宫实验结果Table 2 The results of Y-maze test(±s)

表2 Y迷宫实验结果Table 2 The results of Y-maze test(±s)

注:*P＜0.05,**P＜0.01,***P＜0.001 vs.生理盐水对照组;#P＜0.05,##P＜0.01 vs.随机水平(33.3%)。Notes:*P＜0.05,**P＜0.01,***P＜0.001 vs.the control group(0 mg/kg);#P＜0.05,##P＜0.01 vs.random level(33.3%).

Baclofen/(mg·kg-1)0 1.0 2.5 7.5 Time in novel arm/s 120.69±7.55 101.66±9.09 86.72±9.78*57.37±15.9***Total number of arm visit 40.45±3.58 34.00±3.66 26.67±3.04**13.25±3.75***Total ambulation of arm visit 1 545.18±438.12 1 370.33±384.98 1 236.58±577.83 637.75±509.57***Percentage of time in novel arm 44.26±2.65##38.68±3.31 33.01±3.91 31.54±6.12 Percentage of cross num in novel arm 37.14±1.39#38.23±1.75#39.74±2.29#33.66±2.60 Percentage of ambulation in novel arm 42.39±3.44#40.47±4.07 40.95±2.99#28.26±4.54

3 讨论

在本研究中,我们检测了巴氯芬对小鼠行为表现的影响。结果表明,巴氯芬能够剂量依赖性地损伤小鼠的空间识别记忆能力;当给予高剂量(7.5 mg/kg)的巴氯芬时,小鼠的运动能力和探索能力出现降低,但所有剂量的巴氯芬都不影响小鼠的焦虑程度。

巴氯芬能够激活GABAB受体,从而产生抑制性作用。在突触前,GABAB受体的激活能够抑制电压门控钙通道,减少囊泡神经递质的释放[24];GABAB受体激活还可通过抑制腺苷酸环化酶减少囊泡募集,并因此降低环磷酸腺苷的活化[25]。巴氯芬作为GABAB受体激动剂,还能抑制囊泡融合,从而减少神经递质的释放。巴氯芬抑制兴奋性谷氨酸和天冬氨酸释放到突触后神经元上,致使突触后神经元具有更大去极化的可能性,从而产生抑制作用[26]。例如,在人和啮齿类动物中,神经元gamma和theta频段的震荡在记忆的形成中起重要作用[27],海马中锥体细胞突触后的GABAB受体激活,能够降低神经元的gamma震荡,从而影响学习与记忆能力[26]。

根据Dellu等[22,28～29]的描述,探索型Y迷宫是一种检测动物空间识别记忆能力的实验范式。该迷宫不需要学习规则,并且避免了奖赏和惩罚对小鼠行为表现的影响。在本实验的对照组与低剂量组(1.0 mg/kg)中,小鼠在新异臂中的探索次数百分比都显著大于随机水平(33.3%),这与Dellu等[22,28～29]的描述一致。当给予高剂量巴氯芬(7.5 mg/kg)时,小鼠在Y迷宫的空间识别记忆能力出现损伤,这与Franek等[9]的实验结果一致,他们报道了长时程高剂量(10 mg/kg,14 days)注射巴氯芬能够降低大鼠的记忆能力。当给予中、高剂量巴氯芬时,与对照组相比,小鼠在新异臂中的探索次数、停留时间和行走距离的百分比均出现不同程度的下降,表明巴氯芬影响小鼠的空间识别记忆能力且具有剂量依赖性。这与Mcnamara等[18]的研究结果一致,Mcnamara等报道巴氯芬剂量依赖性地损伤大鼠在水迷宫中的空间学习能力。此外,当给予中等剂量巴氯芬时,小鼠的运动能力并未受到影响,但小鼠在Y迷宫新异臂中的停留时间百分比已处于随机水平,而在新异臂中的穿梭次数与行走距离的百分比却高于随机水平,表明此时小鼠认知功能已出现部分损伤。已有报道显示,巴氯芬能够影响水迷宫行为表现的最低剂量为2.0 mg/kg[26],本研究使用的中等剂量与其接近。

此前,已有研究使用几种不同的实验范式探究了巴氯芬对认知的影响。比如:有研究使用巴恩斯迷宫和水迷宫等范式发现,巴氯芬能够改善空间记忆和运动障碍[16～17];有报道指出,在水迷宫实验中,巴氯芬损伤空间记忆能力[16]。此外,也有研究使用八臂迷宫等范式发现,巴氯芬对认知无影响或只有在高剂量时有短暂的影响[30]。本文的研究表明巴氯芬能够剂量依赖性地损伤空间识别记忆能力,与上述报道之间的差异可能是由以下几个原因造成的。首先,本研究使用的实验范式与上述不同,Y迷宫排除了奖赏和惩罚对小鼠应激的影响,从而避免了对其行为表现的干扰。其次,在上述实验中,巴氯芬是在行为测试前10 min、15 min或是测试前一个晚上开始注射[11,16,31],而在本研究中,巴氯芬注射时间为行为测试前30 min,这可能对巴氯芬的最终作用产生重要影响,因为巴氯芬通常在注射后0.5～1 h开始起效用[32],并且半衰期约为5 h[23]。

本研究在行为学水平上发现,在基于啮齿类动物自然探索天性的Y迷宫实验中,巴氯芬能够损伤小鼠的空间识别记忆能力,并且这种损伤作用具有剂量依赖性。有文献报道,GABA系统在神经元兴奋/抑制平衡过程中起重要作用,并且在神经系统疾病中出现紊乱[1,6]。因此,后续我们将进一步从电生理水平探究巴氯芬对小鼠兴奋/抑制平衡的影响。

GABA系统具有神经调节作用,目前研究人员已经提出了各种策略,例如激动作用、拮抗作用以及近年来对GABAB受体的正构调节等,这些策略对药物成瘾、焦虑和抑郁等中枢神经系统疾病具有一定的治疗作用。尽管目前关于GABAB受体的生理和病理调节尚不清楚,但是,越来越多的证据表明,GABAB受体将在各种精神疾病和神经退行性疾病的治疗中成为潜在的药物治疗靶标[6～8]。本研究表明GABAB受体在空间识别记忆过程中起重要作用,提示在巴氯芬及其他GABAB受体相关药物的临床应用过程中,相关人员要尤为注意高剂量药物对认知神经系统的影响,从而避免对其产生损伤。