UAS-Mlp84B-GFP转基因果蝇制备及其表达分析

姜婷婷,张佳伟,刘小玲,聂宏运,唐 旻,佘美华,曾 群*

(1.南华大学衡阳医学院附属南华医院检验科,中国湖南 衡阳 421001;2.南华大学衡阳医学院生物化学与分子生物学教研室生态健康与人类重要疾病防控湖南省高校重点实验室,中国湖南 衡阳 421001)

黑腹果蝇作为经典遗传学和分子遗传学模式生物,已经成为研究基因调控器官发育以及各种疾病发生的一个强有力的模型。果蝇心脏系统发生学的研究对确定心脏区域生成、心肌细胞分化和功能性心管形成的主要信号传递事件具有重要意义[1]。果蝇同源域转录因子Tinman及其脊椎动物同源基因NKX2.5在心管形态发生和心脏功能上的作用以及表达模式非常相似,提示无脊椎动物和脊椎动物的心脏发育有可能是由保守的同源通路控制的[2～6]。

LIM结构域蛋白被认为是高度保守的锌指基序,目前已经有近30年的研究历史。起初,LIM来源于3种调节同源结构域转录因子的首字母:Lin-1(一种细胞系蛋白质)、Isl1(胰岛素增强结合蛋白质)和Mec3(一种机械感觉神经元分化蛋白质),表明LIM结构域在胚胎发育、基因表达以及作为压力/应变传感器中发挥作用[7]。由于锌指基序与GATA型锌指非常相似,人们认为它们可能参与结合特定的DNA序列,但目前尚不清楚LIM结构域与哪一类DNA元件结合[8]。Isl1和Mec3的LIM结构域抑制同型结构域与其DNA靶标的结合,一些LIM结构域蛋白是参与细胞谱系确定和模式形成的转录因子,还有一些LIM结构域蛋白则与细胞骨架有关,并在黏着斑和肌动蛋白微丝组织中发挥作用[9～11]。LIM结构域蛋白家族可在细胞关键生命进程中作为适配体或支架支持蛋白质复合物的组装,尤其是介导多蛋白质复合体组装,从而参与调控多种细胞信号转导途径[12]。LIM的蛋白质序列还包括额外的蛋白质结合模块(如PDZ、PET、激酶结构域),它们赋予LIM蛋白特定功能并影响其亚细胞定位[13]。现有研究发现,人类有数百个LIM结构域蛋白,绝大多数在细胞质定位并发挥功能,但少数含有核定位或核输出序列,使它们能够在细胞核内外发挥作用[14]。

果蝇的心脏祖细胞对称分布在背侧中胚层。在心脏发生过程中,这些祖细胞迁移到背侧中线并形成可收缩的线状心管,这一过程与脊椎动物早期心脏发育极为相似。果蝇的心脏由两种不同类型的细胞组成,即内层可收缩的心肌细胞和外层不可收缩的副心肌细胞[15]。目前研究发现,果蝇中的36个基因可编码出75个不同的LIM结构蛋白,其中41.7%的LIM结构基因在果蝇心脏肌肉组织中表达,并在果蝇肌肉结构、心脏发育、心脏功能以及造血系统发挥重要作用[15]。

Mlp84B是一种肌肉LIM蛋白(MLP),属于LIM-only家族,其表达定位于肌节Z盘[16～17]。有研究表明,人类MLP基因在肌肉拉伸感知反应中起着关键作用,其突变与肥厚和扩张型心肌病有关[18]。小鼠LIM结构域蛋白CRP2是果蝇Mlp84B的同系物,在血管系统,尤其是在平滑肌细胞中表达。CRP2基因敲除小鼠心脏超微结构表现出轻微的肥大表型[19]。在胚胎发育后期至整个成体阶段,果蝇Mlp84B与α-actinin、D-titin在心脏组织中共定位。其突变纯合子在蛹期致死,杂合子显示心动过缓和心律异常表型,并影响果蝇的寿命[20～21]。

目前,由于缺乏Mlp84B抗体,人们无法在果蝇体内进行大规模Mlp84B互作蛋白质的筛选,因此本研究旨在给Mlp84B基因带上一个内源融合表达的绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)标签,以应用GFP标签抗体更好地指示Mlp-84B的表达以及筛选互作蛋白质。本研究以黑腹果蝇为材料,首先将果蝇含有内源启动子元件的Mlp84B基因组融合GFP序列克隆至pUAST表达载体中,利用胚胎显微注射技术将构建好的重组质粒注射到果蝇早期受精卵;其次通过杂交获得红眼果蝇,经单果蝇建系、平衡子定位后获得稳定遗传的转基因果蝇;再次通过检测GFP的表达定位以及Mlp84B的mRNA表达水平,验证UASMlp84B-GFP转基因果蝇是否构建成功;最后应用文中构建的转基因果蝇,在体内证实果蝇Mlp84B与Act57B蛋白互作。我们成功构建的Mlp84B-GFP转基因果蝇可以作为肌肉的标记品系,便于在体内大规模筛选和建立肌肉系统的Mlp84B互作蛋白质网络,为探究肌肉细胞形成奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 果蝇品系

W1118(野生型果蝇,显微注射背景果蝇)、Sp/Cyo;MKRS/TM6B(2.3号双平衡子果蝇)和Act5C-Gal4(广泛表达启动子果蝇)均为本实验室保种品系;Hand-Gal4(心脏组织表达启动子果蝇)由湖南师范大学吴秀山教授赠送。

1.2 质粒

转座酶质粒pΔ2-3用于辅助显微注射;质粒pUAST-GFP含UAS元件和GFP片段,用于制备转基因果蝇。以上质粒均为本实验室保种。

1.3 试剂

本研究使用的试剂主要包括:gDNA Mini kit(CS11204,美国Invitrogen公司),反转录试剂盒、ClonExpress®Ultra One Step Cloning Kit和 Phanta Flash Master Mix(上海诺唯赞生物科技有限公司),QIAGEN质粒抽提试剂盒(德国QIAGEN公司),anti-GAPDH抗体(武汉博士德生物工程有限公司),anti-GFP抗体(英国Abcam公司),anti-Act57B抗体(本实验室制备),限制性核酸内切酶(上海生工生物工程股份有限公司),DNA分子量标准(碧云天生物技术有限公司)。

1.4 pUAST-Mlp84B-GFP质粒构建

以W1118果蝇幼虫基因组为模板,利用PCR方法扩增Mlp84B基因组片段(含3 613 bp上游启动子序列、1 445 bp不含终止密码子的基因组序列;F 引物 5＇-AAACAAATGGGACTGTGT-3＇,R引物 5＇-GAACGTTGTCAAAGCGCC-3＇),并在其两端加上pUAST-GFP载体同源臂序列,左同源臂序列为 5＇-TGAATAGGGAATTGGGAATTC-3＇,右同源臂序列为 5＇-TCGAGCGCGGCCGCAAGATCT-3＇。使用2×Phanta Flash Master Mix和含有同源臂序列的引物对目的基因进行PCR扩增,并经PCR产物回收试剂盒纯化Mlp84B基因组片段,同时用EcoRⅠ和BglⅡ将pUAST-GFP载体线性化,最后采用ClonExpress®Ultra One Step Cloning Kit将线性化的pUAST-GFP载体和Mlp84B片段进行同源重组连接,获得pUAST-Mlp84B-GFP重组表达质粒。

1.5 转基因果蝇制备及鉴定

1)采用QIAGEN质粒抽提试剂盒获取高纯度的pUAST-Mlp84B-GFP重组质粒和pΔ2-3转座酶质粒。2)准备注射用DNA:首先,吸取25 μg pUAST-Mlp84B-GFP 重组质粒和 5 μg pΔ2-3辅助质粒(含转位酶基因),加入1/10倍体积3 mol/L的NaOAc后,3倍体积无水乙醇混匀;其次,-80℃冷冻沉淀60 min,4℃、12 000 r/min离心15 min后去除上清;再次,用70%乙醇对沉淀物进行漂洗,4℃、12 000 r/min离心5 min后去除上清;最后,37℃干燥沉淀物,并吸取50 μL注射缓冲液[5 mmol/L 的 KCl、0.1 mmol/L 的 NaH2PO4(pH 6.8)]溶解沉淀物。3)胚胎显微注射:收集发育30 min的W1118果蝇胚胎,30%次氯酸钠处理2 min后,将脱去绒毛膜的胚胎头尾一致地排列在双面透明胶上,待胚胎干燥1～2 min后,滴1滴halocarbon oil覆盖胚胎,通过显微操作仪将DNA注射到胚胎后端略微偏离中心的位置,即极细胞的位置;在注射完的胚胎附近涂一层酵母糊,将胚胎置于18℃、60%湿度的环境下继续培养2～3 d。4)转基因果蝇的筛选鉴定:将注射后羽化的果蝇单个与W1118果蝇杂交,挑选出F1红眼果蝇,并将其单个与双平衡系杂交,最终通过杂交确定转基因插入在哪一条染色体上。5)采用Western-blot和荧光显微镜检测红眼果蝇GFP的表达及定位。

1.6 基因克隆相关PCR反应混合液配制及反应程序

在PCR反应管中依次加入16 μL的RNasefree water、2.5 μL 的 2× Ex Taq buffer、2.5 μL 的dNTPs、2.6 μL 的上下游引物(10 μmol/L)、1 μL 的DNA模板和0.4 μL的Ex Taq DNA聚合酶,充分混匀。PCR反应程序:95℃预变性5 min;95℃变性5 min,55℃退火30 s,72℃延伸1 min,30个循环;72℃终延伸5 min;4℃保存产物。

1.7 实时荧光定量PCR反应混合液配制及反应程序

在96孔PCR反应管中依次加入4.9 μL的RNase-free water、10 μL 的 2× SYBR Premix Ex TaqⅡ、2.5 μL 的 dNTPs、1.6 μL 的上下游引物(10 μmol/L)和 1 μL 的 cDNA 模板,充分混匀。PCR反应程序:95℃预变性10 min;95℃变性15 s,60℃退火30 s,72℃延伸30 s(收集荧光),40个循环;紧接着做溶解曲线分析。

1.8 免疫共沉淀

提取转基因果蝇幼虫总蛋白质,测定浓度;将总蛋白质分成两份,1份作为Input(不加抗体),1份作为实验组(加入GFP抗体);取150 μL的总蛋白质和1 μg的GFP抗体,4℃孵育4 h,随后加入50 μL预先封闭好的免疫沉淀(immunoprecipitation,IP)用的磁珠,4℃孵育过夜;将样品放在磁力架上静置10 s,吸走上清;加入500 μL的RIPA摇洗10 min,重复5次;加入50 μL的RIPA重悬磁珠,然后加等体积的上样缓冲液,沸水煮5 min;进行Western-blot实验,选择Act57B抗体进行显影。

2 结果

2.1 成功构建pUAST-Mlp84B-GFP质粒

为了制备Mlp84B-GFP转基因果蝇,首先要获得pUAST-Mlp84B-GFP重组质粒(质粒示意图见图1A)。我们以W1118果蝇3龄幼虫基因组为PCR模板,扩增带有和线性化pUAST-GFP载体同源末端的Mlp84B基因组序列,通过同源重组酶获得pUAST-Mlp84B-GFP质粒,并用EcoRⅠ和BglⅡ对3个候选阳性重组质粒进行双酶切鉴定,分别得到约5 kb的Mlp84B片段和13 kb的pUAST-GFP片段(图1B,泳道1～3)。泳道1～2的质粒可能是浓度太高,酶切消化不完全,因此最后将泳道3的质粒进行DNA测序,并进行比对。测序结果证实,Mlp84B片段连入pUAST-GFP正确的位置(图1C)。以上结果表明,我们成功构建了pUAST-Mlp84B-GFP重组质粒。

图1 pUAST-Mlp84B-GFP重组质粒构建(A)pUAST-Mlp84B-GFP重组质粒载体示意图;(B)pUAST-Mlp84B-GFP重组质粒的酶切电泳图。用EcoRⅠ和BglⅡ双酶切3个候选阳性质粒(泳道1～3),分别获得13 kb pUAST-GFP和5 kb Mlp84B两个片段(M:D0110 DNA分子量标准);(C)泳道3质粒的DNA测序部分波峰图。Fig.1 Construction of recombinant plasmid pUAST-Mlp84B-GFP(A)Schematic diagram of recombinant plasmid pUAST-Mlp84B-GFP;(B)Gel electrophoresis of pUAST-Mlp84B-GFP recombinant plasmid with restriction enzyme digestion.EcoRⅠand BglⅡwere used to digest 3 candidate positive plasmids(lanes 1～3),and two fragments of 13 kb pUAST-GFP and 5 kb Mlp84B were obtained.M:D0110 DNA ladder;(C)Partial DNA sequence chromatogram of the Lane 3 plasmid.

2.2 成功构建UAS-Mlp84B-GFP转基因果蝇

为了鉴定显微注射技术获得的果蝇是否是目的转基因果蝇,我们首先将F0果蝇与W1118果蝇杂交,保留F1红眼果蝇;接着将F1红眼果蝇与Sp/Cyo;MKRS/TM6B平衡子果蝇杂交,分别获得了定位在1号(Tg1)和2号(Tg2)染色体的稳定遗传的F2转基因果蝇。为了进一步鉴定该转基因果蝇中的目的基因是否表达,我们首先利用荧光显微镜对F1转基因果蝇进行观察,发现F1转基因果蝇幼虫可见绿色荧光,且荧光主要集中在肌肉系统(图2A)。其次,我们利用UAS/GAL4二元表达系统,将UAS-Mlp84B-GFP果蝇(F2)与Hand-Gal4果蝇杂交,在荧光显微镜下我们观察到Hand-Gal4＞UAS-Mlp84B-GFP果蝇心肌细胞发绿色荧光(图2B),说明Hand-Gal4启动子成功驱动Mlp-84B-GFP在心脏组织中高表达,为后续Mlp84B在心脏组织中的功能研究奠定了基础;同时,将UAS-Mlp84B-GFP果蝇(F2)与Act5C-Gal4果蝇杂交,显微观察结果显示,Act5C-Gal4＞UASMlp84B-GFP果蝇全身可见绿色荧光(图2C),说明Act5C-Gal4启动子成功驱动Mlp84B-GFP在全身组织中高表达。最后,我们提取转基因果蝇幼虫总RNA进行qRT-PCR,以检测Mlp84B的表达,结果显示,与野生型果蝇相比,Tg1和Tg2转基因果蝇的Mlp84B的表达分别升高2.85和2.80倍(图2D);同时,对获得的红眼转基因果蝇以及W1118果蝇进行蛋白质提取,并利用GFP抗体进行免疫印迹实验,结果显示,转基因果蝇有GFP表达,而W1118果蝇检测不到GFP蛋白(图2E)。以上结果表明,pUAST-Mlp84B-GFP成功定位到果蝇基因组上,并且能够在Mlp84B自身启动子元件的作用下启动GFP在肌肉组织表达,同时也能利用UAS增强子元件驱动Mlp84B异位表达。

图2 UAS-Mlp84B-GFP转基因果蝇的鉴定(A)F1果蝇幼虫肌肉系统发绿色荧光,红色箭头指示肌原纤维;(B)Hand-Gal4启动子驱动UAS-Mlp84B-GFP,绿色荧光除了在肌肉系统表达之外,还在幼虫心管表达(白色箭头);(C)Act5C-Gal4启动子驱动Mlp84B-GFP,绿色荧光在全身各组织广泛高表达;(D)Tg1和Tg2转基因果蝇Mlp84B的mRNA表达水平相对于野生型W1118果蝇分别上升了2.85和2.80倍。***P＜0.01,ns表示无显著性差异,n=3,数据用平均值±标准误(±s)表示,两组间比较采用t检验;(E)通过免疫印迹实验能够在Tg1和Tg2转基因果蝇体内检测到GFP蛋白的表达,而W1118果蝇中无GFP蛋白的表达。Fig.2 Identification of UAS-Mlp84B-GFP transgenic Drosophila(A)Green fluorescence appearing in the muscular system of F1 Drosophila larva.Red arrows indicate myofibrils;(B)Green fluorescence appearing in larval cardiac(white arrow)in addition to the muscular system.UAS-Mlp84B-GFP was driven by Hand-Gal4 promoter;(C)Green fluorescence protein widely and highly expressed in all tissues of the larval.Mlp84B-GFP was driven by the promoter Act5C-Gal4;(D)The mRNA expression level of Mlp84B in Tg1 and Tg2 transgenic Drosophila was increased by 2.85 and 2.80 folds,respectively,compared with that of W1118.***P＜0.01,ns means no significant difference(n=3).The data are expressed as mean ± standard error(±s)and t test was used for comparison between the two groups;(E)GFP protein could be detected in Tg1 and Tg2 transgenic Drosophila,but not in W1118by Western-blot.

2.3 UAS-Mlp84B-GFP在果蝇肌肉组织表达

从前述结果可知,我们成功构建了UASMlp84B-GFP转基因果蝇,GFP能够在Mlp84B启动子元件的作用下启动表达,因此我们可以通过GFP的表达来示踪Mlp84B蛋白在果蝇体内的定位。在本研究中,我们以Tg1转基因果蝇胚胎、幼虫、蛹以及成蝇为材料,在荧光显微镜下观察GFP的表达定位。结果显示,内源性Mlp84B在果蝇生命周期都有表达,而且主要表达于肌肉系统,其中在胚胎和幼虫阶段的表达量最高(图3)。

图3 Mlp84B-GFP在果蝇肌肉组织中表达通过检测GFP表达,示踪Mlp84B在果蝇胚胎(A)、幼虫(B)、蛹(C)和成虫(D)的表达定位。Mlp84B强烈表达于果蝇肌肉系统。Fig.3 Mlp84b-GFP is expressed in Drosophila muscle tissueThe localization of Mlp84B in Drosophila embryo(A),larvae(B),pupa(C)and adult(D)was traced by detecting GFP expression.Mlp84B was strongly expressed in Drosophila muscular system.

2.4 Mlp84B与Act57B存在相互作用

Mlp84B与Act57B在胚胎肌肉和成体肌肉组织均有表达,并且都是作为Mef2(myocyte enhancer factor-2)的靶标调控肌肉系统的形成和功能[22～23]。为了探究Mlp84B、Act57B两者的作用关系,我们首先利用STRING在线数据库进行分析,发现Mlp84B与Actn、Tm2、Mlc2等多个肌肉蛋白的表达有共定位,这种共定位表达在其他物种中同样存在(图4A),同时,Mlp84B与Act57B存在强烈的物理性相互作用(图4B);其次利用构建的UASMlp84B-GFP转基因果蝇进行体内免疫共沉淀,结果表明Mlp84B与Act57B在果蝇体内存在物理性相互作用(图4C、4D)。基于上述结果,我们推测Mlp84B与Act57B在肌肉组织中能够形成复合体,共同调控肌肉系统的形成和功能。

3 讨论

Mlp84B是一种肌肉LIM蛋白。人类MLP基因在肌肉拉伸感知反应中起着关键作用,其突变与肥厚和扩张型心肌病有关[18]。小鼠LIM结构域蛋白CRP2是果蝇Mlp84B的同系物,在血管系统,尤其是在平滑肌细胞中表达。CRP2基因敲除小鼠的心脏超微结构表现出轻微的肥大表型[19]。肌肉细胞转录因子Mef2通过对肌肉特异性靶基因的转录调控,确定和维持分化的肌肉表型。Mlp84B是已知的dMef2调控靶基因,在胚胎发育后期至整个成体阶段,果蝇Mlp84B与α-actinin、D-titin在心脏组织中共定位,共同调控心脏功能,并影响果蝇的寿命[20]。目前的研究认为,Mlp84B在果蝇Z盘成分缺陷心脏与心肌病发展中发挥重要作用[21],但其在果蝇心脏发育中的作用尚不清楚。本研究将Mlp84B启动子序列和编码序列构建到pUAST-GFP表达载体中,利用胚胎显微注射技术将pUAST-Mlp84B-GFP重组质粒注射到果蝇受精卵,杂交获得稳定果蝇品系后,经qRT-PCR(图2D)、Western-blot(图 2E)验证,获得两类 Mlp84BGFP转基因果蝇,即Tg1和Tg2。我们构建的Mlp-84B-GFP转基因果蝇包含Mef2转录因子结合位点,通过融合表达的GFP可对Mlp84B在果蝇体内的表达进行示踪。本研究的检测结果显示,Mlp-84B-GFP在肌肉组织/肌原纤维高表达(图2A、图3),表明Mlp84B-GFP转基因果蝇可作为果蝇肌肉系统的荧光报告品系。为了探究Mlp84B在肌肉系统中的互作蛋白质,本文通过生物信息学分析筛选了Mlp84B候选互作蛋白质,发现Mlp84B与多个肌肉蛋白质共定位表达且存在相互作用(图4A、4B)。基于此,本研究利用构建的UAS-Mlp84B-GFP转基因果蝇,通过免疫共沉淀实验,在体内证实Mlp-84B与另一个肌肉蛋白质Act57B存在物理学互作(图4C、4D)。我们推测Mlp84B与Act57B在肌肉组织中形成复合体,共同受到肌肉组织转录因子Mef2的靶向调控,最终影响肌肉组织的形成和功能。

图4 Mlp84B与Act57B的相互作用分析(A)生物信息学分析与Mlp84B共定位的蛋白质。左图为在果蝇中与Mlp84B共定位的蛋白质,右图为在其他物种中与Mlp84B共定位的蛋白质;(B)生物信息学分析果蝇Mlp84B的相互作用蛋白质网络;(C～D)Mlp84B与Act57B存在物理相互作用。Fig.4 Mlp84B interacted with Act57B(A)Bioinformatics analysis of the co-localization proteins of Mlp84B in Drosophila(left)and other species(right);(B)Bioinformatics analysis of protein interaction network with the Drosophila Mlp84B;(C～D)Mlp84B interacts with Act57B physically.

此外,生物信息学分析发现,Mlp84B与多个蛋白质有共定位和互作,这些蛋白质大多数在肌肉组织高表达(图4A、4B),并且在果蝇和人类等高等生物中高度保守。我们推测,肌肉LIM蛋白Mlp-84B能够在肌肉组织中建立一个蛋白质互作网络,共同影响肌肉细胞的形成、分化和结构稳定。我们期待利用UAS-Mlp84B-GFP转基因果蝇,通过GFP抗体在蛋白质组学上大规模筛选Mlp84B内源性互作蛋白质,建立一个完善的肌肉蛋白质互作网络,为揭示人类肌肉系统的发生和稳态奠定基础。

总的来讲,本文构建的UAS-Mlp84B-GFP转基因果蝇既可以在Mef2转录因子的作用下启动Mlp84B在所有类型的肌肉细胞中表达,又可以通过UAS-Gal4二元表达系统在Hand-Gal4心脏特异启动子的作用下启动Mlp84B在心脏组织中过表达,为后续研究Mlp84B在心脏组织中的作用奠定了基础。由于构建的UAS-Mlp84B-GFP转基因果蝇只包括上游3 kb的调控序列,并不能完全反映Mlp84B的内源表达情况,所以后续我们还将制备果蝇Mlp84B抗体以及通过CRISPR/Cas9系统构建Mlp84B原位敲入的GFP果蝇,以更加全面地探索Mlp84B的表达及功能。