溶血磷脂酶PNPLA7的研究进展

王 宇,常平安*,黄飞飞

(1.重庆邮电大学生物信息学院,中国重庆 400065;2.重庆市大数据生物智能重点实验室,中国重庆 400065)

含patatin样磷脂酶结构域蛋白(patatin-like phospholipase domain containing protein,PNPLA)在哺乳动物脂质代谢和信号转导中发挥重要作用,近年日益受到广泛关注[1～3]。PNPLA蛋白家族包含9种蛋白质,分为3个亚群,其中第2亚群包括PNPLA6和PNPLA7。PNPLA6和PNPLA7通常分别被称作神经病靶标酯酶(neuropathy target esterase,NTE)和NTE相关酯酶(NTE-related esterase,NRE)[1]。与其他亚群PNPLA成员相比,PNPLA6和PNPLA7除了含有patatin样磷脂酶结构域,还具有明显不同的跨膜结构域(transmembrane domain,TMD)和预测的环核苷酸结合结构域(cyclic nucleotide binding domain,CNBD)[1,4]。

NTE是在研究有机磷酸酯引起的迟发性神经病(organophosphate-induced delayed neuropathy,OPIDN)的机理过程中被发现的[5]。其作为内质网上的一种跨膜蛋白,具有磷脂酶B的活性,催化卵磷脂和溶血卵磷脂的脱酰基反应,调节细胞磷脂代谢,是胚胎发育、神经发育和轴突维持所必需的蛋白质[6～7]。尽管人们对NTE的结构功能与表达特性的认识已经比较清楚,然而有关PNPLA7的研究较少。本文就PNPLA7近年来的研究进展进行了综述,对其酶学特性、表达调控、结构与功能等进行全面介绍,为进一步阐明其生理功能和作用机制奠定基础。

1 PNPLA7是一种内质网上的溶血磷脂酶

PNPLA7是一种在小鼠、人和大鼠等哺乳动物中进化保守的蛋白质[8～9]。小鼠PNPLA7与PNPLA6具有较高的序列相似性和相同的蛋白质结构域(图1):N末端是1个跨膜结构域(TMD)(10～32氨基酸);N端为其调节域,包含3个环核苷酸结合结构域(CNBD)(162～259、473～564、590～680 氨基酸);C端是其催化域,包含1个patatin结构域(924～1 090 氨基酸)[10]。

图1 小鼠PNPLA6和PNPLA7的蛋白质结构域[6,10]Fig.1 Protein domains of mouse PNPLA6 and PNPLA7[6,10]

PNPLA7的外源性和内源性表达结果均显示,其为内质网上的一种膜整合蛋白[8～9,11～12]。PNPLA7通过N末端TMD定位于内质网上,其N末端位于内质网的基质腔中,N末端的TMD镶嵌在内质网上,其余大部分结构(包括调节域和催化域)位于内质网膜的细胞质侧,其中,C-末端面向内质网的细胞质侧,催化域附着在内质网的细胞质侧膜上(图2A)[12]。除了N末端的TMD对PNPLA7的内质网定位起关键作用外,调节域对PNPLA7在内质网上的正常分布也有一定作用,研究报道,缺失调节域的PNPLA7在内质网上呈点状聚集状态[12]。此外,有研究发现,PNPLA7在内质网和线粒体相关膜(mitochondria-associated membrane,MAM)均有表达,并且免疫荧光检测显示PNPLA7部分包裹线粒体[13]。

图2 PNPLA7与内质网和脂滴互作的分子模型(A)正常情况下,PNPLA7通过N末端的跨膜结构域(TMD)镶嵌在内质网(ER)上,调节域和催化域位于内质网膜的细胞质侧,催化域附着在内质网的细胞质侧的膜上;(B)当细胞中cAMP水平升高时,cAMP结合CNBD3,影响调节域的结构,促使催化域结合脂滴(LD)。Fig.2 Molecular model of the interactions of PNPLA7 with the endoplasmic reticulum and lipid droplets(A)Normally,PNPLA7 is anchored on the endoplasmic reticulum(ER)through the N-terminal TMD,the regulatory and catalytic domains are exposed on the cytoplasmic face of the ER membrane,and the catalytic domain is attached to the ER cytoplasmic membrane;(B)When cAMP levels are elevated in cells,cAMP binds to CNBD3 to induce the binding of the catalytic domain with lipid droplets(LDs)through affecting the structure of the regulatory domain.

体外检测发现,PNPLA7具有溶血卵磷脂酶的催化活性,可以水解溶血磷脂酰胆碱(lysophosphatidylcholine,LPC)等溶血磷脂[9]。进一步研究证实,PNPLA7在体外对多种溶血磷脂具有水解活性,并在体内仅对LPC,特别是含有不饱和脂肪酸的LPC,具有强烈的催化活性,释放出脂肪酸和甘油磷酸胆碱[12]。稳定表达PNPLA7显著降低细胞内的含有不饱和脂肪酸(如C16:1、C18:1和C18:2)的LPC含量,而不改变其他溶血磷脂的水平[12]。相反,在细胞内敲除PNPLA7,细胞内的LPC溶血磷脂酶活性显著降低[12]。因此,PNPLA7是一种内质网上的溶血卵磷脂水解酶,催化LPC脱酰基代谢。无论是以人工底物戊酸苯酯,还是以生理底物LPC进行活性测定,研究都发现:PNPLA7的酶活性依赖其催化结构域,而并不依赖其调节结构域[11～12]。位于催化域patatin结构域中的GXSXG模体的丝氨酸(serine,S)是其活性位点氨基酸,能与有机磷酸化合物二异丙基氟磷酸(diisopropylfluo-rophosphate,DFP)结合,抑制酶活性[8]。以戊酸苯酯为底物进行测试,结果显示,在底物浓度为1 mmol/L的弱碱性(pH 8.0～8.5)溶液中,PNPLA7的催化活性最强[9]。

2 PNPLA7的表达受营养状态调控

PNPLA7在脂肪组织、骨骼肌、心肌和脂质代谢活跃的睾丸等组织中具有相对丰富的表达[8～11]。作为一种在脂肪组织中高表达的溶血磷脂酶,PNPLA7的表达受到营养状态的调节。在喂食状态下,小鼠各个组织中的PNPLA7的表达相对较低;禁食则增强PNPLA7在脂肪组织、心肌、骨骼肌、睾丸和肝脏等组织中的表达[9,11];饥饿后再喂食则又降低PNPLA7的表达[14]。定量PCR分析发现,禁食调控PNPLA7的转录剪接,增加有活性的PNPLA7的表达,降低无活性的剪接突变体的表达[11]。相对喂食正常食物的小鼠,喂食高脂肪食物的小鼠肝脏的PNPLA7表达明显增加;并且相对正常小鼠,PNPLA7在db/db肥胖小鼠肝脏中的表达也明显增加[14～15]。

研究报道,在小鼠3T3-L1前脂肪细胞分化为成熟脂肪细胞的过程中,PNPLA7的表达在早期明显下降,而在中后期显著升高;在已分化的小鼠3T3-L1脂肪细胞中,胰岛素剂量相关性地抑制PNPLA7的表达[9,14]。另外,单不饱和脂肪酸油酸增加脂肪细胞中PNPLA7的表达,饱和脂肪酸棕榈酸则不影响PNPLA7的表达[14]。因此,无论是在动物机体上还是在脂肪细胞中,PNPLA7的表达都受营养状况的调节;而且,PNPLA7可能在脂肪代谢和能量稳态维持中起一定作用。此外,PNPLA7蛋白受泛素-蛋白酶体途径和自噬降解,并且调节域中的破坏盒(destruction box)和N-末端的TMD分别是泛素-蛋白酶体途径和自噬降解PNPLA7所必需的结构[16～17]。

3 PNPLA7调控肝脏脂肪代谢与脂肪肝发展进程

PNPLA7的组织分布、催化活性、细胞定位以及表达特性等提示,它可能在脂质代谢和能量代谢中起一定作用。在COS-7细胞中稳定表达小鼠PNPLA7,能显著降低细胞内的含有不饱和脂肪酸的LPC含量,而不改变其他溶血磷脂的水平[12]。此外,在肝癌细胞Huh7中表达PNPLA7明显降低脂肪积累[18],而敲减PNPLA7的表达,小鼠肝脏中的脂肪积累增加[19]。有研究报道,在敲减PNPLA7的肝细胞中回补表达PNPLA7及其无活性的突变体,肝细胞中的脂肪水平恢复正常[15],这表明PNPLA7调控肝脏脂肪代谢与其活性无关。分子机制研究表明,PNPLA7通过与载脂蛋白E(apolipoprotein E,ApoE)的直接相互作用(这种互作不依赖PNPLA7的催化活性),抑制ApoE经泛素-蛋白酶体途径的降解,从而增强其稳定性,促进极低密度脂蛋白(very-low-density lipoprotein,VLDL)的分泌,降低脂肪在肝细胞中的积累[15]。在敲减肝脏PNPLA7的小鼠中,肝脏VLDL的分泌减少,促进脂肪在肝脏中的积累,导致脂肪肝的发生[15]。这种作用只发生在饥饿状态下,而不发生在正常喂食和高脂肪喂食状态下[15],进一步表明PNPLA7在能量代谢中的调节功能受营养状态的调控。综上可知,PNPLA7在肝脏中通过与ApoE互作,影响其稳定性,并通过调节VLDL的分泌,调控脂肪在其中的积累。

肝脏PNPLA7的表达水平与血浆中脂肪和ApoE的含量呈正相关[15]。PNPLA7的表达升高可增强肝脏脂肪以VLDL的形式分泌到循环系统中,促进外周组织对脂肪的摄取,这表明PNPLA7在肝脏和血浆脂质稳态协调中发挥一定的作用。虽然相关研究发现,在喂食高脂肪、肥胖小鼠和脂肪肝病人的肝脏中PNPLA7的表达上调[14],但是当PNPLA7敲减后,肥胖小鼠肝脏中脂肪积累并没有逆转反而加剧[15]。因此,PNPLA7的表达增高可能不是肝硬化的驱动力,而更可能是削弱肝硬化的一种潜在反馈调控机制。在非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)患者中,PNPLA7表达较高的患者的脂肪肝病情一般较轻,并且肝脏中的PNPLA7 mRNA表达随着脂肪肝严重程度的增加而逐渐降低[15]。有研究发现,在肝癌细胞系和组织中,PNPLA7的表达下调[20]。这提示,PNPLA7表达可能是脂肪肝的良好预后标志物,PNPLA7表达较低的脂肪肝患者可能发展到诸如肝癌等严重状态。因此,PNPLA7可能在NAFLD演变为非酒精性脂肪变性(nonalcoholic steatosis,NAS)的过程中发挥一定作用。

4 环核苷酸调控PNPLA7与脂滴的结合

脂滴(lipid droplet,LD)作为中性脂(脂肪和固醇酯)储存的细胞器,是成熟脂肪细胞的显著特征结构。内质网是脂滴形成的场所,脂滴外周单层磷脂的成分从高到低依次为磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺和磷脂酰肌醇[21]。此外,脂滴外周的单层磷脂膜还含有溶血乙醇胺和LPC等溶血磷脂,这些溶血磷脂含有大量的不饱和脂肪酸[22～23]。

亚细胞定位研究发现,融合绿色荧光蛋白(green fluorescence protein,GFP)的PNPLA7除了定位在内质网,还有极少部分附着在脂滴上[9]。我们结合亚细胞定位和细胞器蛋白质的免疫印迹检测发现:独立的C端催化域完全包裹在脂滴上并导致脂滴聚集,其中4个假定的疏水TMD为脂滴靶向模体(LD targeting motif),PNPLA7与脂滴的结合依赖于C端催化域;删除N末端TMD的仅含有调节域和催化域的PNPLA7并不能结合脂滴;而删去调节域的PNPLA7虽然可借助其N末端的TMD镶嵌在内质网上,借助C端催化域与脂滴结合,但并没有导致脂滴成簇聚集[12,24]。这表明,PNPLA7凭借催化域结合脂滴,调节域阻碍催化域与脂滴的结合,N末端的TMD阻止脂滴成簇聚集[24]。

PNPLA7的调节域中存在3个预测的CNBD。环核苷酸,如环腺苷酸(cAMP),可能与CNBD结合,改变调节域的结构,进而影响催化域的结构和功能。在表达PNPLA7的细胞中,加入cAMP类似物8-CPT-cAMP之后,PNPLA7与脂滴的结合明显增加[12]。进一步研究发现,缺失第1个或第2个CNBD后,增加cAMP仍然可以促进PNPLA7与脂滴的结合;而缺失第3个CNBD(CNBD3)后,提高cAMP水平并不能促进PNPLA7与脂滴的结合[12]。这表明,cAMP调节PNPLA7与脂滴的结合依赖第3个CNBD的存在。

相关研究分析了与PNPLA7具有高度相似序列的PNPLA6,发现PNPLA6的3个CNBD中只有CNBD3含有脯氨酸-精氨酸-丙氨酸-苏氨酸(PRAT)模体,推测其极可能是cAMP结合的结构域[25]。另有研究发现,增加细胞内的cAMP可以促进PNPLA7与脂滴的结合,但并没有改变其催化活性[12]。因此,cAMP很可能通过直接结合PNPLA7调节域中的CNBD3改变调节域的结构,进而影响催化域的构象,调节催化域与脂滴的相互作用,使其在特定细胞器(内质网和脂滴)之间发挥作用(图 2B)。

5 展望

作为内质网膜上的一种溶血磷脂酶,PNPLA7水解溶血卵磷脂,调控磷脂代谢,然而PNPLA7介导的磷脂代谢的生理作用并不完全清楚。PNPLA7主要在脂肪组织、心肌、骨骼肌等脂肪代谢和能量转换活跃的组织中高表达,并且其表达受到营养状态的调控。研究发现,肝脏中PNPLA7通过与ApoE互作调节ApoE经泛素-蛋白酶体途径的降解,影响VLDL的分泌,从而调控肝脏脂肪的代谢,并且PNPLA7与ApoE的互作与其催化活性无关[15]。但是,PNPLA7与ApoE互作调控ApoE稳定性的分子机制,以及PNPLA7的溶血磷脂酶活性在肝脏脂肪代谢中的作用,至今尚不清楚。PNPLA7对小鼠肝脏脂肪代谢的调控发生在禁食状态。禁食状态下,PNPLA7的表达增强,抑制ApoE经泛素-蛋白酶体途径的降解,促进脂肪以VLDL的形式分泌,降低脂肪在肝细胞中的积累,维持脂肪代谢稳态和能量平衡。那么,禁食状态下PNPLA7在肝脏中调控脂肪代谢的作用机制是否同样存在于其他组织或器官？这也有待进一步的研究证实。

研究表明,cAMP水平调控PNPLA7与脂滴的相互作用[12]。在禁食状态下,儿茶酚胺类激素,如去甲肾上腺素和异丙肾上腺素等,结合脂肪细胞质膜上偶联着鸟苷酸结合蛋白Gαs的β-肾上腺素受体,激活腺苷酸环化酶,增加cAMP水平[26]。这样禁食不仅增强PNPLA7的表达,而且可能通过增加cAMP,促进PNPLA7从内质网到脂滴的转位从而结合脂滴,PNPLA7水解脂滴表面的LPC,改变脂滴表面的单层磷脂膜结构,促进脂肪分解。胰岛素是负调控脂肪分解的主要激素。胰岛素结合其受体,通过胰岛素受体底物1和2,激活磷脂酰肌醇3激酶,增加3-磷酸肌醇,激活蛋白激酶B,蛋白激酶B通过稳定其底物含α/β水解酶结构域蛋白15和直接磷酸化激活磷酸二酯酶3B(phosphodiesterase 3B,PDE3B),分解降低cAMP水平[26]。胰岛素在脂肪细胞中不仅抑制PNPLA7的表达,而且可能通过降低cAMP水平,促进PNPLA7与脂滴的分离,抑制脂肪分解,促进脂肪合成。因此,进一步探究在各种营养状态下,PNPLA7介导的溶血磷脂代谢在肝脏以外的其他组织(如脂肪和肌肉组织等)中的作用,包括调控脂肪和能量代谢等,将更加深刻地揭示PNPLA7的生理功能。在这其中,PNPLA7与内质网、脂滴等细胞器的相互作用及其对特定细胞器脂质代谢的调控,无疑是在分子和亚细胞水平上更加深入地阐释其作用机制。