乙型肝炎病毒相关慢加急性肝衰竭患者血清miRNA差异表达谱及其预后预测价值

谢志伟 陆霭琪 杨可立 陈彬彬 关玉娟 肖光明 李剑萍

肝衰竭是由多种因素引起的严重肝脏损伤，病死率高。乙型肝炎病毒相关慢加急性肝衰竭(hepatitis B virus-related chronic and acute liver failure，HBV-ACLF)占肝衰竭总数的81.80%[1]。ACLF病理生理机制复杂，发病机制尚不明确[2, 3]。研究发现，miRNA参与了生物体多种生理过程，如在HBV感染者血循环中多种miRNA的表达量发生变化，且随着HBeAg状态不同，其miRNA表达不一样，HBeAg阳性患者的血清miRNA-122-5p、miRNA-125b-5p、miRNA-192-5p、miRNA-193b-3p及miRNA-194-5p水平较HBeAg阴性患者高[4-7]。miRNA通过调控死亡受体介导的肝细胞凋亡来参与肝衰竭的发病，miRNA-122-3p可以作为HBV-ACLF预后独立预测因子，HBV-ACLF死亡患者血清miRNA-200a表达水平明显高于生存患者[8-10]。针对目前HBV-ACLF临床治疗效果差，本研究拟寻找早期诊断、预测HBV-ACLF临床疗效及预后的miRNA。

材料与方法

一、研究对象

纳入2018年5月至2019年5月就诊于广州医科大学附属市八医院乙型肝炎病毒感染患者，HBV-ACLF诊断标准参照《肝衰竭诊治指南(2018年版)》[11]。纳入标准：①年龄18～65岁，性别不限；②HBsAg 阳性持续 6 个月以上；③血清总胆红素≥10×ULN 或每日上升≥17.1 μmol/L；凝血酶原活动度≤40%或 INR≥1.5；④能理解本研究并签署知情同意书，并且遵守本研究的要求。排除标准：①合并HIV、HCV、HEV、HDV感染，合并自身免疫性肝炎、酒精性肝病、代谢性肝病等肝病；②合并其他器官严重的基础性疾病；③依从性差。

研究分为HBV-ACLF组、慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B，CHB)组及健康对照(healthy control，HC)组；HBV-ACLF组再分为好转组与未愈组，未愈组定义为患者出院时肝功能变差或死亡；收集患者临床资料如人口学特征、病毒学指标、血常规、生化、凝血功能、电解质及纤维化指标。

二、微小RNA测序及数据分析

使用TRizol试剂盒(Invitrogen, Carlsbad, CA, 美国)从患者的外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMC)中分离总RNA。为了获得RNA的完整性和质量，使用安捷伦2100生物分析仪(安捷伦技术公司)测量每个样本的RNA完整性数(RIN)值。按照制造商的协议，使用NEB Multiplex Small RNA library Prep Kit (New England Biolabs Inc.)制备文库。康宸生物技术(上海)在Illumina-NextSeq500平台上进行高通量测序和数据分析，首先对原始数据进行修剪和处理，调整后P<0.05视为差异表达。

三、实时定量聚合酶链反应(quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR)验证miRNA

利用SYBR Green PCR试剂盒对CFX-96进行实时Q-PCR分析，分析所选miRNA和一个内参U6基因的表达情况。采用标准2-ΔCt法计算miRNA的表达。

四、统计学分析

采用SPSS Statistics 25.0分析数据。正态分布的计量资料用均数±标准差表示，采用两两比较的Student’t检验，偏态分布的计量资料以M(P25，P75)表示，比较采用Mann-WhitneyU检验；3组间比较采用单因素方差分析。P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、患者人口学及临床特征比较

共纳入75例研究对象，男59例，女16例，年龄(39.7±9.1)岁；HBV-ACLF组30例，年龄39.0(34.8，48.3)岁，男25例(占83.3%)；CHB组20例，年龄38.5(27.0，49.8)岁，男12例(占70%)；HC组 25例，年龄38.0(33.5，43.0)岁，男20例(占80.0%)；3组研究对象年龄、性别比较，差异无统计学意义(P>0.05)。HBV-ACLF组与CHB组、HC组比较，具有较低的红细胞计数、血红蛋白水平、血小板计数及较高ALT、AST水平，且miRNA-144-3P、miRNA-205-5p、miRNA-96-5p、miRNA-137-3p、miRNA451a表达上调，差异均有统计学意义(均P<0.05)，而肌酐水平及白细胞计数差异无统计学意义(P>0.05)。

HBV-ACLF组患者30例，分为好转组17例及未愈组13例，两组性别、年龄、HBV DNA水平、白细胞计数、红细胞计数、血红蛋白水平、肝肾功能、电解质及纤维化指标差异无统计学意义(P>0.05)。与未愈组比较，好转组具有更高的血小板计数及更好的凝血功能，差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。

表1 HBV-ACLF好转组与未愈组患者临床特征比较

二、HBV-ACLF患者与HC患者miRNA表达谱

为明确miRNA在HBV-ACLF患者PBMC中表达情况及筛选出可能发挥作用的miRNA，采用Exiqon公司基于LNA(锁核酸)开发的miRNA芯片分析技术，收集10例HBV-ACLF患者和5例健康人的PBMC分别进行基因芯片杂交验证，然后合成比对。最后合成的miRNA-microarray芯片结果，与健康对照组人群比较，按照2倍倍数变化(fold change>2)，P<0.05，在HBV-ACLF患者体内65个miRNA发生了显著变化，其中上调miRNA 25个(图1A)，下调芯片miRNAs 40个(图1B)。

图1 通过基因芯片技术发现HBV-ACLF患者血清中表达异常的血清miRNA

三、miRNA 对 HBV-ACLF患者预后的预测价值

进一步扩大样本，纳入HBV-ACLF患者20例，CHB患者20例，选取同期健康人20例作为健康对照组，分析miRNA表达差异情况。HBV-ACLF组与CHB组、HC组比较，miRNA-144-3p、miRNA-205-5p、miRNA-96-5p及miRNA451a表达上调，差异有统计学意义(P<0.05)。而miRNA-137-3p表达差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 3组研究对象miRNA表达差异情况

20例扩大验证的HBV-ACLF患者中，好转组11例，恶化组9例。两组miRNA表达水平比较，miRNA-144-3P、miRNA-137-3p及miRNA451a表达差异无统计学意义(P>0.05)，好转组miRNA-205-5p及miRNA-96-5p均为上调表达，且差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 HBV-ACLF患者好转组与未愈组miRNA表达差异情况

讨 论

本研究发现，与CHB患者及健康人群比较，HBV-ACLF患者红细胞计数、血红蛋白水平及血小板水平较低，与既往报道一致。研究发现，相比于非ACLF患者及健康人群，ACLF患者炎症因子水平明显升高[12, 13]。Lippi等[14]报道，炎症因子如肿瘤坏死因子α、白细胞介素-1β及白细胞介素-6可能抑制铁代谢和促红细胞生成素的产生，导致合成障碍或促红细胞生成素异常活动，这或许是ACLF患者红细胞计数及血红蛋白下降的原因。本研究也发现HBV-ACLF未愈患者血小板下降更明显，凝血功能更差。许珊珊等[15]发现ACLF患者血小板下降明显，且死亡组血小板比存活组下降更明显，但2组血浆促血小板生成素(thrombopoietin，TPO)水平无显著差异，提示ACLF患者血小板减少的原因可能为消耗或重新分布，并非TPO水平下降导致血小板生成减少。

miRNA作为一种在转录后水平调控基因表达的内源性非编码单链 RNA，不仅在不同疾病状态下表达谱不同，而且可以稳定地存在于血液、血清等体液中。不同miRNA在肝脏疾病也发挥不同作用[6, 16]。本研究筛选HBV-ACLF患者血清中表达显著异常的miRNA，发现与健康人比较，HBV-ACLF患者血清中有65个miRNA发生了显著变化，其中上升最高的为miRNA 27-5P和 miRNA 199b-5P。有研究发现，肝细胞癌患者miRNA 199b-5P表达下调，而miRNA 199b-5P的过表达可抑制癌细胞聚集、细胞迁移及扩散，miRNA 27-5P的表达可抑制乳腺癌细胞的扩散及诱导肿瘤细胞周期的停止[17，18]。本研究扩大样本后发现，与CHB患者及健康人群相比，HBV-ACLF患者miRNA-144-3p、miRNA-205-5p、miRNA-96-5p、miRNA-451a均表达上调，且好转患者，miRNA-96-5p和miRNA-205-5p均上调表达。miRNA-96-5p可以减轻脂多糖诱导的炎症反应，其主要机制为通过降低酰胺磷酸核糖转移酶表达水平和抑制NF -κB通路，miRNA-205-5p可以抑制疤痕的形成，主要通过抑制人瘢痕疙瘩成纤维细胞的侵袭和迁移能力，及抑制血管内皮生长因子的表达从而抑制PI3K/Akt 通路[19，20]。而目前认为免疫调节失衡和过度的炎症反应是ACLF发生发展过程中的重要病理生理机制[12, 21-23]，为此，通过免疫调节及抑制炎症反应可以改善ACLF的预后。

综上所述，miRNA-96-5p和miRNA-205-5p在HBV-ACLF患者中表达水平升高，且与HBV-ACLF患者预后密切相关，有望成为 HBV-ACLF 诊断和预后评价的新指标。由于本研究入组病例数相对较少，有待扩大样本量进一步研究。