基于数据挖掘和网络药理学分析社区获得性肺炎用药规律和机制*

张晨曦，关胜男，谢凯，张康，王海峰

1.河南中医药大学，河南 郑州 450046； 2.河南中医药大学第一附属医院呼吸科，河南 郑州 450000； 3.呼吸疾病中医药防治省部共建协同创新中心，河南 郑州 450000

社区获得性肺炎(community acquired pneumonia，CAP)是一种由多种病原体引起的急性肺部感染性疾病，有高发病率和病死率[1]。随着人口老龄化、免疫功能减弱、宿主数量增多和抗生素耐药性增加等问题，CAP的发病率持续增长[2]。有研究表明，依据感染指标指导的抗生素滥用率在55%以上，且其耐药性在全球范围内迅速蔓延，对公众健康造成了严重威胁[3-4]。中医药治疗呼吸系统疾病具有独特优势和显著疗效，且具有多靶点、不良反应少、统筹整体的特点[5]。研究表明，中药治疗CAP能明显改善临床症状，降低炎症指数，调节免疫功能[6-9]。CAP属中医“风温肺热”“咳嗽”范畴[10]。临床上关于中药治疗CAP的研究多为随机对照试验、动物实验、系统及疗效评价等，缺少方药总结和机制探索。因此，本文通过挖掘具有明显临床治疗效果的常用代表方药，总结经典药对，采用网络药理学筛选出药物的核心化学成分，分析其作用的靶点和机制，并结合中药性能阐释中医药治疗CAP的有效性和科学性。

1 资料与方法

1.1 文献来源本研究所搜集的文献主要来源于知网、万方医学数据库和维普资讯等数据库，检索时间为数据库建立至2021年8月。以“社区获得性肺炎”“肺炎”“肺部感染”“风温肺热病”“中医”“中医药”“中草药”“中药”为主题词，限定文献类型为实验性研究、观察性研究、名老中医经验、医案、验案等。

1.2 文献纳入标准①符合CAP且病种单一，无较多合并症，年龄大于18岁；②有明确的方药组成；③有明显的临床疗效；④单纯的汤剂治疗。

1.3 文献排除标准①排除妊娠期和哺乳期妇女；②排除重复方药、中西药联用、中药针剂、复合制剂、中药贴敷、针刺治疗；③排除动物实验、疗效与系统评价、综述、指南、共识。

1.4 文献整理与数据规范所筛文献查重后由两名工作人员通过对文献标题及摘要进行首次剔除，由第3名工作人员浏览全文确定最终文献。将文献中所记载的所有方剂名、中药、中医证型记录于Excel 2019软件中，参考2015年版《中华人民共和国药典》和2004年版《中医药学名词》对所记载的中药名进行规范，如“酒军”更改为“大黄”，“新会皮”更改为“陈皮”，“元参”更改为“玄参”，“淡子芩、条芩”更改为“黄芩”等。

1.5 数据挖掘利用Excel 2019软件对药物进行描述性统计分析，获得高频药物，利用SPSS Modeler软件对所有药物进行关联规则分析，获取药物之间的关联度。利用SPSS Statistics软件对药物进行系统聚类分析，最后结合药物频率、关联规则及聚类分析结果得出中药治疗CAP的核心配伍药对。

1.6 网络药理学通过中药系统药理学数据库与分析平台(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP)筛选出核心配伍药对的有效化学成分并获取相应的靶点，通过蛋白质分析数据库(universal protein，UniProt)匹配靶点的基因名(物种限定为人类)。在OMIM、GeneCard、Grugbank数据库，以“Community acquired pneumonia”为检索词，将所有的疾病靶点合并、去重，得到CAP的疾病靶点，并通过UniProt数据库矫正基因名。使用Venny2.1.0(http：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)获取药物和疾病的交集靶点，将交集靶点和药物靶点导入Cytoscape3.7.1软件构建疾病-药物-化学成分-靶点网络，获得药物核心化学成分。通过STRING(https：//string-db.org)获取“string_interractions.tsv”文件，导入Cytoscape软件，构建蛋白质相互作用(protein-protein interaction，PPI)网络，找到核心靶点。基于Metascap(http：//metascape.org/)进行基因本体(gene ontology，GO)功能富集分析、京都基因与基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)通路富集分析，了解核心靶点的生物信息和信号通路。

2 结果

2.1 高频药物频次与频率共筛选到文献8 794篇，剔除相关文献后获得286篇论文，方剂168篇，其中包含266味中药。通过Excel 2019软件进行描述性统计分析得出频率大于10%的高频药物有27味，见表1。

表1 高频药物频次与频率

2.2 高频中药关联规则与可视化在SPSS Modeler软件中采用Apriori算法对高频中药进行关联规则分析，设置最小支持度为10%，最小规则置信度为80%，最大前项数为2。获得两项药对组合两个，分别是麻黄→杏仁、薄荷→连翘。3项药对组合5个，分别是麻黄、杏仁→石膏，麻黄、石膏→杏仁，麻黄、黄芩→石膏，麻黄、黄芩→杏仁。其中麻黄→杏仁配伍支持度最高为16.67%，置信度>90%，出现频次最高为28次，见表2。将关联规则结果进行网络可视化处理，见图1。27种高频药物在设置链接数≥15时，显示杏仁、黄芩、麻黄、鱼腥草、金银花等药物之间关系密切；当链接数≥25时，显示杏仁、黄芩、甘草、麻黄等药物之间关系密切。

表2 高频药物组合关联规则(支持度>10%，置信度>80%)

2.3 高频中药聚类分析与可视化将27种高频药物数据信息整合，依据是否在同一处方中出现分别记为“1”和“0”，导入SPSS Statistics软件进行系统聚类分析，采用组间联接法，设置区间为Pearson相关性，获得谱系图，结果显示当截距值取为12.5时，麻黄、杏仁、石膏可聚为一类，见图2。结合关联规则中，在置信度>80%的条件下，麻黄→杏仁支持度最高，考虑麻黄与杏仁为治疗CAP的核心配伍药对。

2.4 “麻黄-杏仁”化学成分和靶点网络构建通过TCMSP平台检索麻黄、杏仁，筛选出口服吸收率≥30%、类药性≥0.18的有效化学成分，结果显示：麻黄的有效化学成分有23个、杏仁有19个，两者分别有452个、182个成分靶点。将麻黄和杏仁

图1 高频药物关联规则网络图

图2 27种高频中药聚类谱系图

图3 药物-疾病靶点基因韦恩图

图4 药物-疾病-化学成分-交集靶点网络图

的成分靶点去重后分别为217个、70个靶点，通过UniProt数据库对靶点进行基因名矫正。通过OMIM、GeneCard、Grugbank数据库，以“Community acquired pneumonia”为搜索词检索疾病靶点，所有疾病靶点合并去重后余135个，并通过UniProt数据库矫正基因名，与药物靶点基因取交集得54个，即麻黄-杏仁的有效化学成分作用于疾病的靶点，见图3。将药物靶点、疾病靶点、交集靶点进行整理，生成"network" "type"文件，导入Cytoscape软件构建“药物-疾病-化学成分-交集靶点”网络图(图4)。该网络包含213个节点，306条边，蓝色和紫色分别为麻黄和杏仁的有效化学成分，绿色为药物的基因靶点，红色为疾病和药物的交集基因靶点。对网络图进行分析，选择度值排名前5位作为麻黄与杏仁的核心化学成分，分别是槲皮素(quercetin)、植物甾醇(stigmasterol)、柚皮素(naringenin)、甘草查尔酮B(licochalcone B)、β-谷甾醇(β-sitosterol)，相关度值见表3。

表3 核心化学成分及度值

2.5 基于String和Cytoscape软件的PPI网络构建将交集靶点基因上传至String平台，获取“string_interractions.tsv”文件，导入Cytoscape软件并构建PPI网络，即核心药物与疾病PPI网络图，见图5。根据度值调整网络图参数，圆圈代表每个蛋白质目标，连接线代表蛋白质目标之间的紧密程度。圆的大小、颜色、连接线的粗细、线条颜色与蛋白靶点的重要性呈正相关。白细胞介素-6(interleukin-6，IL-6)、丝氨酸激酶B(AKT1)、IL-1β、肿瘤蛋白p53(oncoprotein p53，TP53)、基质金属蛋白酶9(matrix metalloproteinase 9，MMP9)、胱天蛋白酶3(caspase 3，CASP3)、CXCL8、血管细胞黏附因子-1(vascular cell adhesion molecule-1，VCAM1)、细胞间黏附分子-1(intercellular adhesion molecule-1，ICAM1)、1SERPINE1等 10个蛋白靶点可能是药物与疾病交互作用的重要靶点。其中IL-6、AKT1、IL-1β、MMP9、CXCL8这5个靶点与呼吸系统密切相关，可作为此次研究的核心靶点。

图5 核心药物-疾病PPI网络

2.6 分子对接验证将5个核心靶点基于蛋白质结构数据库获取蛋白结构，进行分子对接。结合能见表4，对接结构可视化可见图6—图10。5个核心靶点与中药核心化学成分结合能均小于-5 kcal·mol-1，均有较强的结合作用。

表4 分子对接结合能

图6 AKT1与5种核心化学成分对接图

图7 CXCL8与5种核心化学成分对接图

图8 IL-6与5种核心化学成分对接图

图9 IL-1β与5种核心化学成分对接图

图10 MMP9与5种核心化学成分对接图

2.7 GO功能富集分析、KEGG通路富集分析依据Metascape数据库对交集靶点进行GO功能富集分析、KEGG通路富集分析。在GO功能富集分析中取富集得分前10位，从生物过程(biological process，BP)来看，麻黄与杏仁的核心化学成分主要参与了凝血的正调控、氧化应激诱导的内在凋亡信号通路的负调控、一氧化氮生物合成过程的正调控、一氧化氮代谢过程的正调控、凝血机制调节、纤溶、止血调节、血管收缩的正调控、凝血调节。在细胞组成(cellular component，CC)方面，核心化学成分作用的位置可能是小窝、质膜筏、膜筏、膜微区、肽酶复合物、富含ficolin-1的颗粒管腔、高尔基体、含胶原细胞外基质、核基质、核外围。从分子功能(molecular function，MF)来看，核心化学成分可能影响了一氧化氮合酶结合、蛋白磷酸酶2A结合、无序结构域特异性结合、氧化还原酶活性、核心启动子序列特异性 DNA 结合、肿瘤坏死因子受体超家族结合、蛋白酶结合、蛋白激酶C结合、转录共调节子结合、丝氨酸水解酶活性，生物注释与富集得分见图11。KEGG通路富集分析则根据count值选取前20条通路，将其可视化，见图12。点越大表示该通路上所富集的基因越多，颜色越深表示P值越小。其中位于前10位的通路主要有流体剪应力与动脉粥样硬化、晚期糖基化终末产物和受体(AGE-RAGE)信号通路、癌症相关的通路、爱泼斯坦-巴尔病毒感染、丙型和乙型肝炎、磷脂酰肌醇-3激酶/丝氨酸/苏氨酸激酶(PI3K/AKT)信号通路、结核，考虑核心靶点可能作用于这些通路上。

图11 BP、CC、MF生物注释和富集得分

图12 KEGG通路富集分析气泡图

3 讨论

本文对286篇文献，168个方药进行梳理规整和数据分析，发现在CAP的临床治疗中，麻黄与杏仁可作为核心药对。两者均入肺经，一辛一苦，辛能升发，苦能敛降，宣降相因，共奏降气化痰平喘之功，为宣降肺气常用组合。临床上也常应用于外感风寒表实证、外感风寒内兼郁热证、外感风寒肺失宣降证等。

槲皮素、植物甾醇、柚皮素、甘草查尔酮B、β-谷甾醇为麻黄、杏仁发挥药效的核心化学成分。有研究表明，槲皮素可以促进自噬反应，通过调节活性氧的产生和病毒的生命周期，从而达到抗氧化、抗病毒和抗炎作用[10-11]。柚皮素作为柚皮苷的苷元，属二氢黄酮类化合物，具有抗炎、抗病毒、抗氧化、保护心脏等多种生物性能[12]，可通过抑制核苷酸结合域样受体蛋白3(NLRP3)炎症小体、核转录因子信号(NF-κB)通路，减少细胞毒性，降低肺支气管的炎症反应，改善肺损伤程度[13-15]。甘草查尔酮B为甘草的提取物，其所含的生物活性有抗革兰阳性细菌作用，对耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌的作用尤为突出[16]。此外，甘草查尔酮B同样也抑制NF-Kb信号通路的能力，具有很好的抗炎作用[17]。β-谷甾醇多存在于植物油、绿植和果蔬中，在抗炎、抗肿瘤、抗氧化、调节免疫等方面有独特的药理活性[18-19]。Zhou等[20]研究发现，β-谷甾醇通过下调促凋亡因子来减轻视黄酸诱导基因I介导的肺泡上皮细胞的凋亡损伤，对病毒感染的肺损伤有较好改善作用。Yuk等[21]研究发现，β-谷甾醇能减少嗜酸性粒细胞浸润及杯状增生，改善黏液分泌过多的现象，从而可以减轻肺部炎症。Mahajan等[22]发现，β-谷甾醇通过抑制细胞反应，减少2型T辅助细胞(Th2)细胞因子的释放与合成，减轻肺部和气道炎症。

10个蛋白靶点中与呼吸系统疾病密切相关的核心靶点主要有IL-6、AKT1、IL-1β、MMP9、CXCL8。其中，IL-6、IL-1β、CXCL8为炎症反应中的重要细胞因子，是中性粒细胞诱导趋化因子和炎症的关键介质[23]。机体发生感染或组织损伤时，炎症细胞会迅速产生IL-6[24]。IL-1β会诱导各种趋化因子，影响外周循环的炎症因子聚集至肺组织结构，加重肺部炎症[25]。尚立芝等[26]发现，通过抑制CXCL8、CXC趋化因子受体1(CXCR1)、CXC趋化因子受体2(CXCR-2)的基因表达，可以控制炎细胞趋化，减缓疾病进程。丝氨酸激酶(AKT1)参与糖代谢、调节细胞增殖、分化和凋亡过程。MMP参与各种生理过程中的组织重塑，如血管再生和伤口修复。已有研究证明，MMP-9在糖尿病和代谢疾病中的作用[27]。张永标等[28]在临床中发现，CAP患者血清MMP-9水平明显上升，推测MMP-9可参与CAP的炎性反应过程。

KEGG通路富集分析中PI3K/AKT信号通路与哮喘、COPD、急性肺炎等呼吸系统密切相关。P13K/AKT信号通路参与了气道和肺部的炎症反应[29-30]。该通路能够激活炎症反应和细胞凋亡调节因子，产生肿瘤坏死因子、IL等炎性因子[31]。PI3K/AKT通路也是病毒感染影响各种细胞功能的重要机制[32]，通过抑制PI3K的表达，能够抑制IL-1β、IL-18等炎症因子的活化[33]。除此之外，抑制PI3K/AKT通路能够改善气道重塑和降低炎症反应，抑制Th2细胞因子的产生，减少嗜酸性粒细胞浸润和气道黏液，降低气道高反应性[34-35]。其余通路参与CAP作用机制的相关科研证据尚不充分。由此，PI3K/AKT信号通路参与支气管及肺部的炎症反应过程及气道重塑过程，作为麻黄-杏仁参与CAP的重要通路之一。

综上所述，本文总结了CAP的临床用方规律，对其进行描述性统计分析、关联规则和系统聚类分析，得出麻黄和杏仁是临床CAP的常用药对组合。槲皮素、植物甾醇、柚皮素、甘草查尔酮B、β-谷甾醇为其发挥药效的核心化学成分，发挥抗炎、抗氧化、抑制炎症产生相关信号通路的作用，并作用于IL-6、IL-1β、AKT1、MMP9、CXCL8等蛋白靶点，参与PI3K/AKT信号通路，从而达到减轻肺部炎症反应，改善临床症状的治疗效果，为今后中西医治疗CAP的临床诊疗提供理论依据。