五味子总木脂素的富集及微乳制备研究

许煜晨，丁文文 ，赛那，刘晶，尹东阁，刘曼婷，彭胡麟玥，王开心，杨玉畅，胡盼祥，倪健*，曲昌海*（.北京中医药大学中药学院，北京 0488；.北京中医药大学生命科学学院，北京 0488；.内蒙古医科大学药学院，呼和浩特 000）

五味子为木兰科植物五味子[

Schisandra chinensis

（Turcz.）Baill.]的干燥成熟果实，习称“北五味子”，临床主要用于收敛固涩、益气生津、补肾宁心，归肺、心、肾经。木脂素类成分是五味子发挥多种功效的有效成分，具有心肌再灌注损伤的保护作用，可用于治疗心肌梗死，可通过减少自由基的产生及抗氧化作用从而减少癫痫发作次数，通过减轻脑组织神经元变性和脱失防治阿尔茨海默病，通过上调miR-101-5p的表达来减轻肝纤维化，缩短小鼠的睡眠潜伏期，且具有明显的抗炎、抗焦虑作用。课题组前期研究发现，五味子醇甲等木脂素类成分对于高渗和炎症引起的角膜上皮细胞损伤具有良好的保护作用，具有成为干眼症有效治疗药物的潜力。但是，木脂素多为亲脂性成分，在水中溶解性非常低，不利于滴眼给药。而微乳作为一种新型给药系统，在口服、黏膜、透皮、注射给药及中药制剂中均有广泛应用，能有效提高脂溶性药物的溶解度和生物利用度，在干眼症等眼表疾病的药物递送中也发挥着重要作用。因此，本文拟采用回流提取-大孔树脂吸附工艺对五味子总木脂素进行富集，并建立测定木脂素类成分的HPLC 方法，以8 种成分的总含量为指标对提取纯化工艺进行优化；在此基础上进行总木脂素微乳的处方工艺研究，以期制备得到一种载药量高、粒径均匀的五味子木脂素微乳制剂。

1 仪器与试药

1.1 仪器

1200 型高效液相色谱仪（美国安捷伦公司）；DZTW 型电子调温电热套（北京中仪泓瑞科技发展有限公司）；FW-100 型高速万能粉碎机（北京科伟永兴仪器有限公司）；DHG-9023 型电热鼓风干燥箱（上海一恒科学仪器有限公司）；RE-52AA 型旋转蒸发仪（北京天林恒泰科技有限公司）；FD-1A-80 ＋型冷冻干燥机（北京博医康实验仪器有限公司）；MS105DU 型万分之一天平[METTLER TOLEDO 仪器（上海）有限公司]；VM-504 型涡旋混合器（群安实验仪器有限公司）；JY92-IIN 型超声波细胞粉碎机（宁波新芝生物科技股份有限公司）；ZEN-3600 型马尔文激光粒度仪（英国马尔文公司）；TDL-40B 型低速台式大型离心机（上海安亭科学仪器厂）。

1.2 试药

五味子醇甲（批号：Y30N10H104712）、戈米辛D（批号：M05J9S65019）、五味子醇乙（批号：P4N10F103016）、当归酰戈米辛H（批号：P17J9F65870）、五味子酯乙（批号：P07M6S1）、五味子酚（批号：PJ0607SA13）、五味子甲素（批号：R12O8F45508）、五味子乙素（批号：Y26F11Y17148）（纯度：98%，上海源叶生物科技有限公司），乙腈、甲醇为色谱级（Fisher 公司），娃哈哈纯净水（杭州娃哈哈集团有限公司），大豆油（上海源叶生物科技有限公司），吐温-80（天津百伦斯生物技术有限公司），AB-8 大孔树脂（东鸿化工有限公司），五味子饮片（安徽桐花堂中药饮片科技有限公司），经北京中医药大学刘春生教授鉴定为木兰科植物五味子[

Schisandra chinensis

（

Turcz

.）Baill.]的干燥成熟果实。

2 五味子提取物中8 种成分的测定

2.1 色谱条件

色谱柱：Agilent zorbax SB-C（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：水（A）-乙腈（C），梯度洗脱（0 ～17 min，50%A；17 ～30 min，50%→25%A；30 ～40 min，25%→40%A；40 ～45 min，40%→50%A）；检测波长：254 nm；流速：1.0 mL·min；柱温：25℃，进样量：10 μL。

2.2 混合对照品溶液的制备

取五味子醇甲、戈米辛D、五味子醇乙、当归酰戈米辛H、五味子酯乙、五味子酚、五味子甲素、五味子乙素8 种对照品适量，精密称定，置同一量瓶中，加适量甲醇超声溶解，甲醇稀释至刻度，摇匀，得质量浓度分别约为0.23、0.02、0.06、0.04、0.05、0.01、0.02、0.03 mg·mL的混合对照品溶液。

2.3 供试品溶液的制备

精密称取五味子提取物冻干粉10 mg，置10 mL 量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度。吸取适量过滤，取续滤液进样测定。

2.4 方法学考察

2.4.1 专属性考察 取混合对照品溶液、供试品溶液及空白溶剂（甲醇）进样检测。色谱图见图1，在样品及对照品出峰处溶剂无干扰，方法专属性良好。

图1 混合对照品（A）、供试品（B）和空白溶剂（C）的HPLC 色谱图Fig 1 HPLC chromatograms of mixed reference substance（A），test substance（B）and blank solvent（C）

2.4.2 线性关系考察 精密吸取2、2.5、3、3.5、4 mL 混合对照品溶液，置于10 mL 量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，得系列浓度对照品溶液，进样测定，以对照品质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，并求得线性回归方程，结果见表1。各成分在线性范围内与峰面积线性关系良好。

表1 8 种木脂素成分的线性关系考察结果Tab 1 Linearity of 8 kinds of lignans

成分线性方程r线性范围/（mg·mL －1）五味子醇甲y ＝1849.7x ＋150.54 0.9992 0.046 ～ 0.092戈米辛Dy ＝951.1x ＋3.23920.9993 0.004 ～ 0.008五味子醇乙y ＝1455.8x－10.742 0.9991 0.012 ～ 0.024当归酰戈米辛H y ＝1792.3x ＋6.6320.9992 0.008 ～ 0.016五味子酯乙y ＝1113.2x ＋14.605 0.9992 0.010 ～ 0.020五味子酚y ＝1379.4x－6.7640.9994 0.002 ～ 0.004五味子甲素y ＝1985.2x ＋42.636 0.9991 0.004 ～ 0.008五味子乙素y ＝1730.6x－21.432 0.9992 0.006 ～ 0.012

2.4.3 精密度考察 取混合对照品溶液，连续进样6 次，结果五味子醇甲、戈米辛D、五味子醇乙、当归酰戈米辛H、五味子酯乙、五味子酚、五味子甲素、五味子乙素峰面积的

RSD

值分别为0.21%、0.43%、0.41%、1.5%、0.16%、0.31%、0.85%、1.3%，方法精密度良好。2.4.4 稳定性考察 取同一份供试品溶液，分别在0、2、4、6、8、10、12、24 h 进样测定。五味子醇甲、戈米辛D、五味子醇乙、当归酰戈米辛H、五味子酯乙、五味子酚、五味子甲素、五味子乙素峰面积的

RSD

值分别为0.59%、0.70%、0.69%、0.54%、1.4%、2.3%、0.97%、0.71%，说明供试品溶液在24 h 内稳定性良好。2.4.5 重复性考察 取五味子提取物冻干粉，按“2.3”项下方法制备6 份样品溶液，进样测定。测得五味子醇甲、戈米辛D、五味子醇乙、当归酰戈米辛H、五味子酯乙、五味子酚、五味子甲素、五味子乙素平均含量的

RSD

值分别为0.080%、0.63%、0.46%、0.20%、0.49%、1.4%、0.10%、0.37%，说明方法重复性良好。2.4.6 加样回收率考察 精密称取五味子提取物冻干粉10 mg，共9 份，置25 mL 具塞锥形瓶中，分别加入混合对照品溶液0.8 mL、1 mL、1.2 mL，使低、中、高浓度组中对照品加入量与冻干粉末量之比在0.8∶1、1∶1、1∶1.2 左右，进样测定，计算加样回收率，测得五味子醇甲、戈米辛D、五味子醇乙、当归酰戈米辛H、五味子酯乙、五味子酚、五味子甲素、五味子乙素平均回收率分别为96.7%～101.3%、97.5%～100.8%、96.6% ～103.1%、95.7% ～100.1%、97.1% ～102.5%、98.3% ～100.1%、98.9% ～102.9%、99.4%～102.0%，其

RSD

值分别为2.5%～2.6%、1.6% ～1.7%、3.6% ～3.9%、2.3% ～2.4%、2.7%～2.9%、0.99%～1.0%、0.010%～0.020%、0.010%～0.020%，方法准确性良好。

3 五味子总木脂素的富集和微乳制备研究

在前期研究的基础上，采用“95%乙醇回流提取-回收乙醇并浓缩-70%乙醇醇沉除杂-回收乙醇并浓缩-粗提液-AB-8 大孔树脂柱洗脱-回收乙醇并浓缩-冻干”的提取纯化工艺路线，对五味子中木脂素类成分进行富集。

3.1 五味子总木脂素的富集

3.1.1 提取和醇沉工艺 称取五味子饮片适量，60℃鼓风干燥3 h 后，粉碎成粗粉，备用。称取上述五味子粗粉约50 g，置圆底烧瓶中，加入8倍量95%乙醇，回流提取2 次，每次1 h；合并提取液，减压回收乙醇并浓缩至一定体积。向浓缩液中加入适量95%乙醇，调节醇浓度至70%，搅拌均匀并静置24 h 后，抽滤；上清液减压回收乙醇，并继续浓缩至一定体积得到粗提液，备用。

3.1.2 大孔树脂柱洗脱工艺 AB-8 大孔树脂适量，装柱，径高比1∶8，对AB-8 大孔树脂静态吸附率与静态解吸率进行考察，发现其静态吸附率为90.34%，静态解吸率为67.64%，可知AB-8大孔树脂的静态吸附率较高，解吸性能中等，可通过增加洗脱溶剂的体积来增大解吸率。过柱洗脱过程中发现，采用去离子水与低浓度乙醇梯度洗脱的方式，可有效除去提取液中极性较大的成分，而不流失有效成分。当用100 mL 的95%乙醇洗脱时，有效成分基本被完全洗脱，洗脱曲线如图2 所示。因此确定本品的洗脱工艺如下：取粗提液适量，上样，静置使吸附完全；依次用去离子水50 mL、10%～50%乙醇各20 mL 洗脱，洗脱液弃去；取95%乙醇洗脱至100 mL，收集洗脱液，减压浓缩至无醇味后转移至西林瓶中，冷冻干燥72 h，即得五味子总木脂素冻干粉。

图2 五味子总木脂素提取液洗脱曲线Fig 2 Elution curve of total lignans of Schisandrae Chinensis Fructus

3.1.3 各环节样品及转移率的测定 按照“2.1”项下的色谱条件分别测定五味子饮片、95%醇提液、70%醇沉液、粗提液及冻干粉中8 种木脂素成分含量，计算各环节样品中8 种成分的总含量以及转移率，结果见表2 和表3。结果显示，每一个提取环节转移率均较高，由饮片到冻干粉总体转移率为66.1%。

表2 五味子总木脂素富集各环节的转移率
Tab 2 Transfer rate of total lignans of Schisandrae Chinensis Fructus in each step

总体转移率/%饮片49.82 g 13.54 mg·g－182.7－95%醇提液 1000 mL 0.6197 mg·mL－191.991.9 70%醇沉液 250 mL 2.2978 mg·mL－192.785.2粗提液 60 mL 9.3024 mg·mL－197.282.7冻干粉末 200 mg 445.74 mg·g－179.966.1提取工艺样品量总木脂素含量每步转移率/%

表3 五味子饮片及冻干粉中8 种木脂素成分含量
Tab 3 Contents of 8 lignans in decoction pieces and freeze-dried powder of Schisandrae Chinensis Fructus

化合物饮片/（mg·g－1） 冻干粉末/（mg·g－1）五味子醇甲 5.55245.20戈米辛D 0.37 14.16五味子醇乙 1.59 55.93当归酰戈米辛H 1.02 35.25五味子酯乙 1.26 37.98五味子酚 0.23 5.76五味子甲素 0.97 21.34五味子乙素 2.55 30.12五味子总木脂素13.54445.74

3.1.4 紫外分光光度法测定总木脂素含量 精密吸取配制的五味子乙素对照品0.1、0.2、0.5、1、2 mL，分别置20 mL 比色管中，75 ℃水浴挥去甲醇，依次加入10%变色酸水溶液0.5 mL，浓硫酸3 mL，蒸馏水1.5 mL，摇匀，置沸水浴中加热30 min，溶液呈紫红色，取出放置室温，摇匀，以相应试剂为空白，于570 nm 处测定吸光度，以质量浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标绘制标准曲线，得到回归方程为

y

＝17.96

x

＋0.4246（

r

＝0.9991）。吸取样品溶液0.5 mL，同法操作，测得吸光度值代入标准曲线计算，得到供试品质量浓度为0.06 mg·mL，样品总木脂素的含量为60.85%，8 种木脂素类成分总含量为44.57%，占总木脂素提取物的73.25%。

3.2 五味子总木脂素微乳的制备和评价

采用富集后的五味子总木脂素冻干粉，以大豆油为油相，吐温-80 为表面活性剂，制备五味子总木脂素微乳。对油水比、表面活性剂用量等因素进行考察，筛选出较优的微乳处方；并通过测定粒径、载药量、离心稳定性、pH 值等对所制得的微乳进行质量评价。

3.2.1 油水比考察 称取大豆油与吐温-80 适量，置离心管中，涡旋1 min 混匀，分别加入0.9、1.9、2.9、3.9、4.9、5.9、6.9、7.9、8.9、9.9 g 纯化水，涡旋1 min 混匀，得到初乳；初乳经探针超声乳化（150 W，3 min），得到终乳。观察各管的外观形态，并测定粒径，结果见表4。当水相加入量为5.9 g，即油水比为1∶59 时，所得乳剂的粒径发生突变，继续增大水相比例，粒径变化不大；因此选择油水比为1∶59，进行后续表面活性剂用量的考察。

表4 油水相比例考察实验结果
Tab 4 Experimental results of oil-water phase ratio

序号大豆油/g 吐温-80/g 水相/g 外观形态平均粒径/nm 10.100.680.90 半固体－20.100.681.90 浅黄色液体2203.3±83.80 30.100.682.90 浅黄色液体 916.6±79.50 40.100.683.90 白色液体 906.1±149.40 50.100.684.90 白色液体752.3±8.20 60.100.685.90 透明液体 478.3±33.50 70.100.686.90 乳白色液体437.1±9.60 80.100.687.90 乳白色液体 449.2±30.80 90.100.688.90 乳白色液体409.4±8.70 100.100.689.90 乳白色液体 439.9±15.50

3.2.2 表面活性剂用量筛选 称取大豆油适量，置离心管中，分别加入0.06、0.10、0.20、0.30、0.40、0.50、0.60、0.70、0.80、0.90、1.00、1.10 g 吐温-80，涡旋1 min 使混匀，向各管中分别加入纯化水5.90 g，涡旋1 min 混匀，得到初乳；初乳经探针超声乳化（150 W，3 min），得到终乳，结果见表5。当吐温-80 的用量为0.06、0.10、0.20 g 时，微乳粒径均在300 nm 以下；但放置过程中发现，表面活性剂含量过低会导致微乳分层，稳定性不佳。综合考虑，选择表面活性剂吐温-80 的用量为0.20 g。

表5 表面活性剂用量考察实验结果
Tab 5 Experimental results of surfactant dosage investigation

序号大豆油/g 吐温-80/g 水相/g外观形态平均粒径/nm 10.100.065.90 乳白色（轻微分层）200.4±2.50 20.100.105.90 乳白色（轻微分层）218.5±2.90 30.100.205.90 乳白色（不分层） 276.5±12.40 40.100.305.90 乳白色610.4±107.30 50.100.405.90 乳白色433.5±42.00 60.100.505.90 乳白色569.8±34.60 70.100.605.90 乳白色 1707±130.00 80.100.705.90 淡黄色588.2±29.10 90.100.805.90 淡黄色501.5±28.90 100.100.905.90 淡黄色406.6±21.30 110.101.005.90 淡黄色298.9±27.50 120.101.105.90 淡黄色130.9±40.30

3.2.3 五味子总木脂素微乳的制备 采用优选的微乳处方工艺，进行五味子总木脂素微乳的制备。处方如下：五味子总木脂素冻干粉0.04 g、大豆油0.1 g、吐温-80 0.2 g、纯化水5.9 g。按处方量称取五味子总木脂素冻干粉、大豆油和吐温-80，超声溶解，涡旋混匀，加入处方量纯化水，涡旋1 min 混匀，得到初乳；初乳经探针超声乳化（150 W，3 min），即得。

3.2.4 微乳的体外评价 采用纳米粒径仪测定五味子总木脂素微乳的粒径，采用透射电镜对其形态进行观察，采用离心法测定其离心稳定性。结果显示，五味子总木脂素微乳的pH 值为6.15；平均粒径为（248.3±9.0）nm，粒径分布图见图3；微乳外观呈均匀的球形，形态良好，透射电镜图见图4；经4000 r·min离心15 min，所制得的微乳不产生分层，离心稳定性良好。

图3 五味子总木脂素微乳粒径分布图Fig 3 Particle size distribution of Schisandrae Chinensis Fructus total lignans microemulsion

图4 五味子总木脂素微乳透射电镜图Fig 4 Transmission electron microscopy of Schisandrae Chinensis Fructus total lignans microemulsion

3.2.5 含量测定 取微乳1.0 mL，置10 mL 量瓶中，加入适量甲醇，超声10 min 使破乳，甲醇定容至刻度。取该溶液，0.45 μm 有机滤膜过滤，进样测定，计算本品中各成分含量。平行测定3次，结果见表6，微乳中8 种木脂素成分总含量为2.44 mg·mL。

表6 五味子总木脂素微乳中8种木脂素类成分含量测定结果(＝3)
Tab 6 Determination results of 8 kinds of lignans in total lignans microemulsion of Schisandrae Chinensis Fructus ( ＝3)

化合物含量平均值/（mg·mL－1）五味子醇甲1.35±0.005戈米辛D0.07±0.005五味子醇乙0.31±0.008当归酰戈米辛H0.19±0.005五味子酯乙0.20±0.005五味子酚0.03±0.005五味子甲素0.11±0.008五味子乙素0.18±0.008

4 讨论

4.1 提取过程

本文采用了回流提取法对五味子中的木脂素类成分进行提取。在此过程中，提取后增加70%乙醇醇沉操作，可有效除去提取液中五味子油等高脂溶性成分，而不影响五味子木脂素类成分的保留。

4.2 微乳油相及表面活性剂的选择

制成五味子总木脂素微乳的过程中，选用大豆油作为油相、吐温-80 作为表面活性剂、不加助表面活性剂。五味子总木脂素在各种单纯油相中均难溶，有文献记载大豆油可用作油相。黄芬等制备了以大豆油为油相的稳定的食品级大豆油

W

/

O

微乳。所以选择实验室较常用的大豆油作为油相，且眼用制剂的要求低于静脉注射，大豆油广泛用于静脉注射，较安全。眼用制剂一般选用无毒的非离子型表面活性剂，在亲水基为聚氧乙烯基的非离子型表面活性剂中，以聚山梨酯类溶血作用较小，聚山梨酯中吐温-80 最安全，因此选用。已有文献记载吐温-80 可用于眼用微乳制剂，如张晶等选择卵磷脂∶吐温-80（3∶10）作为混合表面活性剂，制得的环孢素A眼用微乳理化性质良好，符合眼用制剂要求。助表面活性剂一般为短链醇类，常见的助表面活性剂有乙醇、正丁醇、乙二醇、丙二醇、甘油等，有机溶剂大多有刺激性，因此本实验为了减小对眼部的刺激，制备的微乳不加助表面活性剂。

5 结论

本文经提取、纯化及微乳处方研究，制备得到含量约为2.44 mg·mL的五味子总木脂素微乳，平均粒径约为248.3 nm。下一步拟将之用于细胞实验，考察五味子总木脂素对于干眼症所引起的角膜上皮细胞损伤的保护作用。