MTHFR基因遗传变异与缺血性脑卒中易感性的相关性

黄宏山，韦春丽，易雪丽，韦贵将

(1. 广西百色市人民医院，右江民族医学院附属西南医院超声医学科，广西 百色 533000；2. 右江民族医学院附属医院神经内科，广西 百色 533000；3. 右江民族医学院附属医院检验科，广西 百色 533000)

缺血性脑卒中(ischemic stroke，IS)是世界上常见的脑血管疾病[1]。根据最近发布的流行病学调查结果显示，在过去10年里我国IS发病率和患病率一直呈上升的趋势[2-3]，IS已成为威胁广大人民群众健康的重要疾病，IS病因学研究亦成为医学界一项紧迫而重要的任务。亚甲基四氢叶酸还原酶(methylenetetrahydrofolate reductase，MTHFR)是人体内同型半胱氨酸(homocysteine，Hcy)代谢的一个关键酶，它对血液中Hcy维持在一个正常水平上具有重要作用[4]。近年来研究发现，MTHFR基因参与了IS的发生，其遗传变异与IS易感性的关系也成为研究的热点[5-6]。由于基因遗传变异在不同人群中分布有差别，因此不同人群疾病易感性亦有差别[7]。截止目前，MTHFR基因遗传变异位点rs9651118和rs1801133与IS易感性的相关性少有充分研究。因此，本研究对MTHFR基因遗传变异位点rs9651118和rs1801133与IS易感性的相关性展开研究。

1 对象与方法

1.1 对象 病例组为2018年1月1日—2018年6月30日到右江民族医学院附属医院神经内科住院的200例IS患者。每例IS患者均由两名经验丰富的右江民族医学院附属医院神经内科医生根据临床症状、磁共振成像、计算机断层扫描和其它神经血管系统检查诊断。本研究病例组排除复发性IS、出血性脑卒中、心源性脑血管疾病、肿瘤性、外伤性、感染性及脑血管畸形等其他原因导致的脑卒中和原因不明性的脑卒中。病例组男131例，女69例，年龄49～88岁，平均年龄(61.45± 9.07)岁。对照组为2018年1月1日—2018年6月30日到右江民族医学院附属医院进行常规体检的200名健康者。根据体检过程中的临床实验室及影像学检查结果和对体检者的问询，本研究对照组排除重大疾病史、脑卒中史、癌症和遗传性、自身免疫性、神经性或心源性疾病等。对照组男130例，女70例，年龄46～80岁，平均年龄(60.41±6.70)岁。本研究已获得右江民族医学院附属医院伦理委员会批准，所有病例和对照均已签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 PCR扩增 抽取2 mL病例或对照者静脉血，提取血细胞基因组DNA(Transgen公司)后-80 ℃ 保存。从National Center for Biotechnology Information上下载MTHFR基因组序列，在Primer Premier 5软件(Premier Biosoft公司)上设计MTHFR基因遗传变异位点rs9651118及rs1801133扩增和延伸引物，再由上海生工公司合成。引物信息如表1所示。20 μL的PCR反应体系：2.0 μL的10×PCR反应缓冲液，2.0 μL的0.3 mmol/L dNTPs，各1.0 μL的10 μmol/L上下游引物，1.0 U的HotStar Taq DNA聚合酶(Qiagen公司)，50 ng基因组DNA。PCR 反应程序：94 ℃ 15 min； 94 ℃ 30 s， 60 ℃ 30 s，72 ℃ 20 s，共35个循环；72 ℃ 10 min。

表1 MTHFR基因遗传变异位点 rs9651118及rs1801133 扩增和延伸引物

1.2.2 基因分型 使用MagS磁珠凝胶回收试剂盒(百奥莱博公司)纯化PCR产物，再进行SNaPshot单碱基延伸反应(Applied Biosystems公司)。反应程序：96 ℃ 2min；96 ℃ 10 s，50 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，共25个循环；4 ℃ forever。延伸产物在毛细管电泳仪(Applied Biosystems公司)上样，最后使用Gene Mapper(Applied Biosystems公司)解析电泳结果。

1.2.3 统计学方法 使用SPSS 17.0软件包进行数据统计分析。采用Hardy-Weinberg遗传平衡检测MTHFR基因遗传变异位点的群体代表性；千人基因组计划数据从Ensembl数据库(http：//asia.ensembl.org/index.html)获取；使用t检验对比年龄分布差异，使用χ2检验对比性别分布差异；使用Logistic回归分析MTHFR基因遗传变异位点基因型和等位基因型分布频率与IS易感性的相关性，使用比值比(Odds Ratio，OR)及其95%置信区间(Confidence Interval，CI)表示IS发生的相对风险度，同时使用性别和年龄校正P值。检验水准=0.05。

2 结果

2.1 MTHFR基因遗传变异位点 rs9651118及rs1801133基因型检测结果 本研究中MTHFR基因遗传变异位点 rs9651118及rs1801133基因型检测结果显示，MTHFR基因遗传变异位点rs9651118存在3种基因型，分别为TT、TC和CC，Sanger测序结果如图1所示。位点 rs1801133存在3种基因型，分别为CC、CT和TT，Sanger测序结果如图2所示。

图1 MTHFR基因SNP rs9651118的Sanger测序结果

图2 MTHFR基因SNP rs1801133的Sanger测序结果

2.2 MTHFR基因遗传变异位点 rs9651118及rs1801133在不同地区人群中的分布对比 本研究中IS组和对照组的年龄和性别差异无统计学意义(P>0.05)，同时两组研究对象的MTHFR基因遗传变异位点 rs9651118及rs1801133基因型分布符合Hardy-Weinberg遗传平衡定律，具有良好的群体代表性。不同地区人群rs9651118及rs1801133基因型和等位基因型频率的比较结果分别如表2和表3所示。本研究MTHFR基因遗传变异位点rs9651118 TT、TC和CC 3种基因型在对照组中的频率分别为34.00%、47.00%和19.00%，T、C等位基因型在对照组中的频率分别为57.50%、42.50%，本研究人群与千人基因组计划中的越南胡志明及中国华南地区人群的频率分布差异有统计学意义(P>0.05)，但是与中国北京、尼日利亚埃多、西班牙伊比利亚及斯里兰卡泰米尔地区人群的频率分布差异有统计学意义(P<0.05)。本研究MTHFR基因遗传变异位点rs1801133 CC、CT和TT 3种基因型在对照组中的频率分别为63.00%、32.00%和5.00%，C、T等位基因型在对照组中的频率分别为79.00%、21.00%，本研究人群与千人基因组计划中的越南胡志明及中国华南地区人群的频率分布差异无统计学意义(P>0.05)，但是与中国北京、尼日利亚埃多、西班牙伊比利亚及斯里兰卡泰米尔地区人群的频率分布差异有统计学意义(P<0.05)。

表2 不同地区人群rs9651118基因型和等位基因型频率的比较

表3 不同地区人群rs1801133基因型和等位基因型频率的比较

2.3 MTHFR基因遗传变异位点rs9651118及rs1801133与IS易感性的相关性 MTHFR基因遗传变异位点rs9651118及rs1801133与IS易感性的相关性分析结果如表4所示。MTHFR基因遗传变异位点rs9651118 TT、TC和CC 3种基因型在IS组中的频率分别为34.50%、45.00%和20.50%，在对照组中的频率分别为34.00%、47.00%和19.00%。在共显性模式中，相比rs9651118 TT基因型，TC和CC基因型对本研究人群罹患IS风险的影响差异无统计学意义(OR=0.92，95%CI：0.59～1.44，P=0.726；OR=1.06，95%CI：0.61～1.85，P=0.828)。在隐性模式中，相比TT + TC基因型，CC基因型对IS罹患风险的影响差异无统计学意义(OR=1.12，95%CI：0.68～1.84，P=0.653)。在显性模式中，相比TT 基因型，CC+ TC基因型对IS罹患风险的影响差异无统计学意义(OR=0.97，95%CI：0.64～1.47，P=0.880)。相比T等位基因型，C等位基因型对IS罹患风险的影响亦差异无统计学意义(OR=1.01，95%CI：0.76～1.33，P=0.960)。MTHFR基因遗传变异位点rs1801133 CC、CT和TT 3种基因型在IS组中的频率分别为56.00%、33.00%和11.00%，在对照组中的频率分别为63.00%、32.00%和5.00%。在共显性模式中，相比rs1801133 CC基因型，CT基因型对本研究人群罹患IS风险的影响差异无统计学意义(OR=1.16，95%CI：0.76～1.78，P=0.493)，但是TT基因型则显著增加IS罹患风险(OR=2.51，95%CI：1.14～5.55，P=0.023)。在隐性模式中，相比CC+CT基因型，TT基因型显著增加IS罹患风险(OR=2.40，95%CI：1.10～5.23，P=0.027)。在显性模式中，相比CC基因型，TT+CT基因型对IS罹患风险的影响差异无统计学意义(OR=2.18，95%CI：0.95～4.97，P=0.064)。相比C等位基因型，T等位基因型亦显著增加IS罹患风险(OR=1.44，95%CI：1.04～2.00，P=0.028)。

表4 MTHFR基因遗传变异位点 rs9651118及rs1801133与IS易感性的相关性

3 讨论

IS是指由于脑部血管堵塞或者狭隘导致脑供血不足，神经细胞大量死亡进而致死或者致残的疾病，它是世界上常见的脑血管疾病，在许多国家中是致死致残的重要因素[1]。在过去10年里，我国IS发病率和患病率一直呈上升的趋势，其中发病率和患病率分别由2007年的119/100 000和1053/100 000上升至2017年的156/100 000和1470/100 000，IS已成为威胁广大人民群众健康的重要疾病，IS病因学研究亦成为医学界一项紧迫而重要的任务[2-3]。Hcy是人体内甲硫氨酸代谢的产物，过往研究显示，血液中上升的Hcy是LAAIS发生的重要危险因素，在临床调查研究中，Hcy上升人群罹患LAAIS的风险显著大于一般人群[8]。MTHFR是人体内Hcy代谢的一个关键酶，它可以将5，10-亚甲基四氢叶酸转换为5-甲基四氢叶酸，后者和Hcy在甲硫氨酸合成酶和维生素B12的催化作用下转变为甲硫氨酸，从而使Hcy保持在一个正常的水平[4]。近年来研究发现，MTHFR基因参与了IS的发生，其遗传变异与IS易感性的关系也成为研究的热点[5-6]。由于基因遗传变异在不同人群中分布有差别，因此不同人群疾病易感性亦有差别[7]。截止目前，MTHFR基因遗传变异位点rs9651118和rs1801133与IS易感性的相关性少有充分研究。

在本研究中，通过检测各200例的IS患者和对照者的2个MTHFR基因遗传变异位点，发现MTHFR基因遗传变异位点rs1801133与IS易感性具有相关性。相比MTHFR基因遗传变异位点rs1801133 CC基因型，TT基因型或者TT+ CT基因型显著增加IS罹患风险；相比C等位基因型，T等位基因型亦显著增加IS罹患风险。在最近一项由MAZDEH M等[5]开展的病例对照研究中，通过对来自伊朗的318例IS患者和400例对照者的rs1801133位点进行检测分析后发现，rs1801133 TT基因型或者TT+ CT基因型相比CC基因型显著增加伊朗人群罹患IS的风险，T等位基因型相比C等位基因型亦显著增加伊朗人群罹患IS的风险。M’BAREK L等[6]通过对来自突尼斯的161例IS患者和114例对照者的rs1801133位点进行检测分析后发现了相似的结果。这两项在不同地区人群中开展的rs1801133与IS罹患风险相关性研究中得到的研究结果，与本研究的研究结果形成了相互验证。National Center for Biotechnology Information中的信息(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/snp)显示，rs1801133位于MTHFR基因的蛋白编码区，当rs1801133位点从C变成T时，其编码的氨基酸从丙氨酸变成缬氨酸，过往研究显示，氨基酸的改变可能会改变蛋白的空间结构，进而影响其功能[9-10]。Hcy是IS发生的一个重要因素，血液中高浓度的Hcy可以诱导血管内皮细胞的凋亡，导致动脉粥样硬化，促进IS的发生[11-12]。如前所述，Hcy代谢同时也与MTHFR酶活性紧密相关[4]。研究表明，MTHFR基因遗传变异位点rs1801133 与Hcy血液水平显著相关。ZHANG S Y等[13]通过分析875例冠心病患者和956例对照者的rs1801133基因型和等位基因型分布情况时发现，rs1801133 TT基因型个体血液中的Hcy水平显著高于CC基因型个体。BAGHERI HAMIDI A等[14]在一项关于白癜风发病与rs1801133基因型分布关系的研究中也得到了类似的结果。而DU X X等[15]则在分析200例IS患者的rs1801133基因型和等位基因型分布情况时发现，rs1801133 TT基因型IS患者血液中的Hcy水平亦显著高于CC基因型IS患者。由此可以初步推测， MTHFR基因遗传变异位点rs1801133基因型从C到T的改变可能影响了MTHFR蛋白的结构和活性，进而升高了血液中Hcy表达水平，最终促进了IS的发生。

在本研究中，MTHFR基因遗传变异位点rs9651118基因型和等位基因型频率在本研究IS患者和对照者中的分布差异无统计学意义。在一项探讨rs9651118与婴儿脑瘫易感性相关性的研究中，HOU R Y等[16]调查了105例脑瘫婴儿和114例对照者rs9651118 位点基因型和分布情况，结果显示，CC基因型相比TT基因型，C等位基因型相比T等位基因型显著增加婴儿脑瘫发生的概率。LIN V C等[17]则在一项关于MTHFR基因遗传变异在前列腺癌预后中作用的研究中发现，rs9651118 CC基因型患者相比TT基因型患者5年生存率显著上升，癌旁组织中MTHFR表达水平相较癌组织显著下降，而rs9651118 CC基因型患者血液中MTHFR表达水平相较TT基因型患者也显著下降，rs9651118 CC基因型可能通过下调MTHFR表达水平，延长了前列腺患者的生存时间。在本研究中，MTHFR基因遗传变异位点rs9651118与本研究人群IS易感性无显著相关性。

综上所述，MTHFR基因遗传变异位点rs9651118与IS易感性无显著相关性，但是rs1801133与IS易感性显著相关。相比rs1801133 CC基因型，TT基因型或者TT+CT基因型显著增加IS罹患风险；相比C等位基因型，T等位基因型亦显著增加IS罹患风险。由于基因遗传变异在不同人群中分布有差别，因此本研究的研究结果有待在世界上其它地区人群中开展的研究结果进一步验证。此外，MTHFR基因遗传变异位点rs1801133影响IS易感性分子机制目前尚未阐明，有待后续研究中进一步阐明。