海南高山榕果实中总黄酮提取工艺的优化

秦延君 潘叶 冯继杏 周安强 王文娇 白丽丽

（海南医学院药学院 海南海口 571199）

高山榕(Ficus altissimaBlume)，又名阔叶榕、大青树榕等，桑科榕属，常绿多年生乔本植物，适用于作行道树、园景树和庭荫树，在中国海南、广西、广东、云南等地均有栽种[1]。作为广东、海南及云南西双版纳地区的民间用药，高山榕叶具有清热、解表和化湿的功效，可用于治疗流行性感冒、疟疾、支气管炎及急性肠炎等[2-3]。黄酮（flavonoids) 是化学结构中具有2-苯基色原酮结构的一类化合物，具有抗肿瘤[4-5]、抗病毒、抗心血管[6]和降血压、抗抑郁[7]、抗氧化[8]等多种药理作用。据文献报道，高山榕气生根、叶及果实中主要含有黄酮类、香豆素类、三萜类及挥发油等成分，已经从高山榕果实中分离鉴定出39 个黄酮类化合物[9]。为探索高山榕果实中总黄酮的提取方法，本研究通过正交试验法提取总黄酮并优化其工艺，为高山榕植物资源的开发利用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 仪器UV1600 型紫外可见分光光度计(北京瑞利分析仪器有限公司)；B210S 分析天平(北京赛多利斯有限公司)；KQ-200KDE 超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；XP205 电子分析天平(瑞士梅特勒托利多)

1.1.2 试剂亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、乙醇等均是分析纯（天津大茂化学试剂厂），水为新制蒸馏水。芦丁（中国食品药品检定研究院，批号：100080-202012）。

1.1.3 试材高山榕果实采摘自海南海口市美林路街边绿化树，经海南医学院杨卫丽教授鉴定为桑科榕属高山榕（Ficus altissimaBlume）果实，阴干后，粉成细粉，备用。

1.2 方法

1.2.1 对照品溶液制备取芦丁对照品在70℃条件下干燥至恒重，并精密称定10.25 mg，置于50 mL 容量瓶，用60%乙醇溶液定容至刻度线后超声5 min，得0.205 mg/mL 对照品溶液。

1.2.2 供试品溶液的制备精确称取干燥粉碎的高山榕果实粉末1.0 g，置于圆底烧瓶中，按照实验设计方案提取一定时间，将提取液进行抽滤，用60%乙醇将滤液定容至50 mL，摇匀，备用。

1.2.3 检测波长的选择分别精密量取对照品溶液、供试品溶液以及空白溶液各 4.0 mL，置于25 mL 的容量瓶中；再精密量取1 mL 的5% 亚硝酸钠溶液，摇匀，放置6 min；加入1 mL 的10%硝酸铝溶液，摇匀，放置6 min；加入8 mL 的4%氢氧化钠溶液，然后用60%乙醇溶液定容，摇匀，放置15 min；于200～600 nm 波长处进行扫描，芦丁对照品溶液与供试品溶液的最大吸收波长均在506 nm 处，故选用506 nm 作为检测波长。

1.2.4 线性范围考察分别精密量取芦丁对照品溶液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL 置于25 mL容量瓶中，按1.2.3 方法进行操作，在波长506 nm处测定其吸光度；以芦丁对照品溶液浓度作为横坐标（X），吸光度为纵坐标（Y），进行线性回归。得到回归方程如下：Y=15.604X-0.015 4，（R2=0.999 7）。由试验结果可知，芦丁在 0～48 mg/L 内线性关系良好，标准曲线见图1。

1.2.5 稳定性考察精密量取4 mL 的供试品溶液于50 mL 容量瓶中，操作同1.2.3，放置于室温及密闭环境下，分别在0、15、30、60、90、120 min 测定其吸光度，RSD为3.6%（n=6）。结果表明，供试品溶液在120 min 之内较稳定，满足试验要求。

1.2.6 精密度试验精密量取4 mL 对照品溶液于50 mL 容量瓶中，操作同1.2.3，于506 nm 进行测定其吸光度，连续测定5 次，其RSD为2.8%（n=5），结果显示，仪器精密度良好。

1.2.7 重复性试验精密量取供试品溶液6 份，操作同1.2.3，分别测定各个溶液的吸光度值，其RSD为1.04%（n=6）。根据结果可知，该分析方法重复性良好。

1.2.8 加标回收试验精密量取1 mL 供试品溶液6 份，分别置于25 mL 容量瓶中，加入芦丁对照品溶液1 mL，操作同1.2.3 项，依次测定其吸光度，以空白液作参比。由表1 可知，回收率在98.20%～100.50%，平均回收率为99.31%，RSD=0.84%（n=6）。结果表明，本试验方法回收率良好，满足试验的要求。

表1 加标回收试验数据

1.2.9 总黄酮的提取工艺优化以料液比1∶25（g∶mL）、乙醇60%、提取2 h 和提取3 次作为基础操作，分别以不同的乙醇体积分数、料液比及提取时间为单因素进行试验操作，试验设计见表2。由于吸光度与总黄酮提取率成正比，故以吸光度表示各因素对总黄酮提取效果的影响。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 料液比对提取效果的影响由图2 可知，随着料液比的增大，高山榕总黄酮得率先增大后减小。随着料液比的逐步增加，高山榕总黄酮与提取剂之间接触越来越充分，总黄酮溶出度增加。当料液比为1∶25（g/mL）时，总黄酮提取率达到最大值；继续增大料液比，反而促进杂质的溶出，抑制总黄酮的溶出，导致高山榕总黄酮提取率降低。

2.1.2 乙醇体积分数对提取效果的影响由图3可知，总黄酮提取率随乙醇体积分数的增大先增大后减小，在50%时到达最大值，继续升高乙醇浓度，总黄酮提取率反而下降，这可能是由于黄酮类物质的极性与乙醇溶液极性相近，有利于总黄酮的溶出；而当乙醇浓度继续增大，脂溶性增强，一些脂溶性物质的溶出逐渐增多，抑制了黄酮类物质的溶出，降低了总黄酮得率。

2.1.3 提取时间对提取效果的影响由图4 可知，随着提取时间的延长，高山榕总黄酮提取率先增大后减小。当提取2.5 h 时，总黄酮的得率达到最大值；继续增加提取时间，导致溶出的总黄酮物质发生氧化、降解等，从而使总黄酮得率降低。

2.2 正交试验结果

称取9 份高山榕粉末，每份1.0 g，加入相应浓度的乙醇溶液，加热回流、过滤，用60%乙醇溶液定容至50 mL 容量瓶中；采用分光光度法测其吸光度，依据回归方程计算含量，正交试验结果见表3，方差分析见表4。由表3、4 可知，各因素的影响作用依次表现为B>C>A>D，即乙醇体积分数>提取时间>料液比>提取次数。由于提取3 次会造成溶剂的浪费、降低提取效率，并且还有可能引入杂质，故综合表3、4，确定高山榕果实中总黄酮的最优提取工艺为A3B1C3D2，即乙醇体积分数为50%，提取时间2.5 h，料液比为1∶25，提取2 次。

表3 正交试验结果

表4 方差分析

2.3 最优工艺验证

为考察上述工艺，以A3B1C3D2为提取条件进行3 组重复提取试验，得出高山榕果实中总黄酮提取率均值达到（1.031±0.004）%。

3 结论

通过上述单因素及正交试验结果可知，4 个因素对高山榕总黄酮得率的影响程度依次为：乙醇体积分数＞提取时间>料液比＞提取次数，其中乙醇体积分数对总黄酮提取率影响较大，在提取时如果采用较高浓度乙醇，将促使大量的杂质溶出，抑制总黄酮的溶出，同时还造成溶剂的浪费，故采用50%的乙醇作为最优提取溶剂。方法学的各项验证均满足实验要求，本试验优化后的提取工艺和方法，适用于高山榕果实中总黄酮的提取。高山榕在我国资源分布广泛，果实采摘后对树木的生长几乎无影响。本研究为高山榕果实中黄酮类活性成分的利用提供了有力支撑，对利用高山榕果实丰富我国药用资源具有一定的意义。