野生灵芝农芝1 号驯化栽培

赖腾强 谢娜 吴伯文

（福建农业职业技术学院 福建福州 350007）

灵芝为我国传统名贵中药，也是我国目前研究和开发较多的药用菌[1]。《本草纲目》记载灵芝有“滋补强壮、延年益寿、利关节、治耳聋”等神奇功效，将其列为药中上品[2]。灵芝含有丰富的生物活性物质，如多糖、三萜、不饱和脂肪酸、生物碱、甾醇类物质等[3]。其中灵芝多糖、三萜是主要药效成分，灵芝多糖具有降“三高”、抗癌、提高免疫力等作用[4]；灵芝三萜具有保肝排毒、抑制肿瘤细胞、抗HIV 病毒、降低胆固醇、调血脂和抗炎等活性[5-6]。

灵芝的药用价值被广泛发掘，其市场需求快速增长，野生灵芝资源已遭到过度采摘和破坏，有些品种已濒临灭绝，保护野生灵芝种群及其生物遗传多样性，对野生灵芝的驯化栽培和仿野生栽培等技术手段进行合理开发利用，具有重大意义[7]。野生灵芝可能具有栽培灵芝所没有的优良性状，存在人们意想不到的优良菌株，值得进行深入研究[8-9]。

在福清市枇杷种植户的枇杷园内采集到一株野生黄褐色灵芝（图1），对其进行菌盖内菌肉组织分离，并进行前端菌丝转接，获取较纯的菌丝体，暂命名为农芝1 号，现保藏于福建农业职业技术学院食用菌栽培实训室。对野生灵芝农芝1号进行驯化栽培研究，了解其生物学特性、栽培特性及多糖、三萜含量，以期为进一步开发农芝1 号提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌株农芝1 号，由福建农业职业技术学院组织分离、保藏；韩国灵芝、日本灵芝、美国灵芝、荷兰紫芝、大红芝，引自江苏省高邮市科学食用菌研究所。

1.1.2 供试培养基母种培养基设4 个配方（自然pH），原种培养基设1 个配方，栽培袋培养基设2 个配方（表1）。原种、栽培袋培养基均添加辅料：麸皮10%、红糖1%、石灰0.5%、过钙0.5%，自然pH。

表1 供试培养基配方及灭菌要求

1.2 方法

1.2.1 野生灵芝组织分离及命名选取野生灵芝幼嫩的子实体，进行菌盖内菌肉组织分离。在超净工作台内，用 75%酒精棉球擦洗进行表面消毒，用长柄手术刀切开野生灵芝子实体，分割成5.0 mm×5.0 mm 菌肉，并将菌肉接种在母种配方①培养基的斜面中间，放在培养箱中以25℃恒温、暗光培养。

分离接种2～3 d 后菌肉周围长出白色菌丝，8～10 d 后菌丝可长满整个试管斜面。挑取无污染、菌丝洁白浓密、气生菌丝多的试管，进行前端菌丝转接获取较纯的菌丝体，暂命名为农芝1 号。

1.2.2 农芝1 号生物学特性研究采用18 mm×180 mm 试管做容器，试管斜面长 8 cm。取5.0 mm×5.0 mm 菌块接种在试管斜面中间，在25℃（温度实验除外）的培养箱中暗光培养，各处理重复5 次。（1）温度试验：采用母种配方①培养基，设7 个梯度温度（5、10、15、20、25、30、35℃）。（2）湿度试验：采用原种培养基，设6 个梯度的湿度（60%、61%、62%、63%、64%、65%），试管装料高8 cm。（3）pH 试验：采用母种配方①培养基，设8 个梯度的pH（5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5）。（4）营养试验：采用母种培养基，设置4 种不同的营养配方①②③④。定期测量菌落直径，取平均值作衡量菌丝生长速度指标；用肉眼观察菌丝体生长粗壮、厚薄等情况，衡量其长势[10]。

1.2.3 农芝 1 号栽培特性研究采用17 cm×33 cm×0.05 cm 的聚丙烯塑料袋装料，每袋料高14 cm，干料重385 g，经高压灭菌后待料温降至25℃以下，按无菌操作规范接种。设6 个灵芝菌株，2 种不同的栽培袋配方A、B（表1）。（1）农芝1 号出芝栽培试验的培养基采用栽培袋配方A；（2）6 个灵芝菌株栽培特性比较试验的培养基采用栽培袋配方B。用原种直接接种栽培袋，各接种50 袋。在温度25℃、湿度65%～70%的走菌室暗光培养，适当通风。走菌期间，观测盖面时间、满袋时间、菌丝长速、菌丝长势等。

对农芝1 号进行出芝栽培试验：（1）袋子开口，在室内自然温度下栽培；（2）在室外桃树下，脱袋覆土栽培。在初步了解农芝1 号具有出芝能力后，与其他5 个不同灵芝菌株进行栽培比较试验，比较不同菌株的栽培特性及灵芝多糖、三萜含量，从而了解农芝1 号生长周期、出芝情况、生物学效率和多糖、三萜含量等，以此判断农芝1 号是否为优良菌株。

当菌丝长满袋或有原基形成时，统一放入栽培室，在自然温度下出芝，按参考文献[11]进行出芝管理。出芝期间，观测现原基时间、分化时间、孢子弹射时间等。当灵芝菌盖边缘的白边变为褐色时即可采收，采收后及时烘干至恒重，烘干温度以不超过60℃为宜。采收期间，观测采收时间、袋单产量、色泽、形状、孢子量、菌柄长、菌盖宽、菌盖厚等。除产量记录第1、2 潮外，其余数据只记录第1 潮。计算生物学效率，其公式为：

式中：BE，生物学效率；Fdw，子实体干重；Sdw，基质干重。

1.2.4 农芝1 号活性成分研究委托福建仙芝楼生物科技有限公司，对配方A、B 栽培的第1 潮灵芝多糖、三萜含量进行测定，按照中国药典[12]的标准；其中，灵芝三萜以齐墩果酸、干基计，灵芝多糖以干基计。

2 结果与分析

2.1 农芝1 号生物学特性

获得纯菌丝体后，对农芝1 号进行生物学特性研究，了解其菌丝生长所需的温度、湿度、酸碱度、营养条件等，从而为进一步栽培创造条件。

2.1.1 不同温度对农芝1 号菌丝生长的影响由表2 可以看出，5℃时，农芝1 号菌丝不萌发；温度10～35℃菌丝均能生长，且随着温度的升高，菌丝萌发时间变早，生长速度加快，长势趋好；温度35℃时，菌丝生长速度减慢，长势趋弱；其中温度25～30℃，菌丝稠密，长势旺；温度30℃时，菌丝生长最快，菌丝长速达0.639 cm/d。

表2 不同温度对农芝1 号菌丝生长的影响

2.1.2 湿度对农芝1 号菌丝生长的影响由表3可以看出，农芝1 号菌丝在湿度60%～65%均能生长，菌丝萌发时间相差不大；湿度60%～63%，随着培养基湿度增加，菌丝生长速度加快，长势趋好；湿度64%～65%，随着培养基湿度增加，菌丝生长速度减慢，长势趋弱。湿度62%～63%，菌丝稠密，长势旺；湿度63%时，菌丝生长最快，菌丝长速达0.522 cm/d。

表3 湿度对农芝1 号菌丝生长的影响

2.1.3 不同pH 对农芝1 号菌丝生长的影响由表4 可以看出，农芝1 号菌丝在pH 5.0～8.5 均能生长；pH 5.0～6.5，随着pH 增加，菌丝萌发时间变早，生长速度加快，长势趋好；pH 7.0～8.5，菌丝萌发时间变长，生长速度减慢，长势趋弱；pH 6.0～6.5，菌丝稠密，长势旺；pH 为6.5 时，菌丝生长最快，菌丝长速达0.616 cm/d。

表4 不同pH 对农芝1 号菌丝生长的影响

2.1.4 不同营养物质对农芝1 号菌丝生长的影响由表5 可以看出，农芝1 号菌丝在供试培养基上均能生长，配方②④菌丝长势最好，配方③较好，配方①长势一般。配方④菌丝长速最快，达0.645 cm/d；其次是配方③（0.583 cm/d）；配方①菌丝长速最慢，只有0.456 cm/d。

表5 不同营养对农芝1 号菌丝生长的影响

2.2 农芝1 号栽培特性

出芝栽培试验结果表明，农芝1 号具有出2潮灵芝的能力（图2、3），脱袋覆土栽培的子实体（图4）性状正常，2 种方式所栽培出的农芝1号子实体形态与野生灵芝基本相同。

2.2.1 不同灵芝菌株生长周期比较从表6 可知，供试灵芝菌株萌发时间一致，均为1 d，但生长周期有所不同。在盖面时间上，美国灵芝最快，只需3 d；其次是农芝1 号、日本灵芝、大红芝，需3.5～4.0 d；荷兰紫芝最慢，需要5.5 d。在满袋时间上，美国灵芝最短，只需28.5 d；其次是大红芝、日本灵芝，需31.5～32.5 d；荷兰紫芝最慢，需要40.5 d。在菌丝长速上，美国灵芝最快，菌丝长速达0.558 cm/d；其次是大红芝，为0.512 cm/d；荷兰紫芝最慢，只有0.381 cm/d。在菌丝长势上，日本灵芝、美国灵芝、大红芝最好，其余的较好。在原基期上，大红芝现原基最早，只需36 d；其次是日本灵芝、农芝1 号，需38～39 d；美国灵芝最迟，需要47 d。在分化期上，农芝1 号、大红芝原基分化最早，只需55 d；其次是韩国灵芝、日本灵芝，需56～57 d；荷兰紫芝最迟，需要66 d。在孢子期上，农芝1 号弹射孢子最早，只需75 d；其次是韩国灵芝、美国灵芝，需76 d；最迟的是荷兰紫芝，需要81 d。大红芝采收期最早，只需90 d；其次是农芝1 号、日本灵芝，需91～92 d；荷兰紫芝最迟，需要103 d。

表6 不同灵芝菌株生长周期比较

2.2.2 不同灵芝菌株子实体形态特征比较从表7 可知，在形状上，韩国灵芝为扇形，荷兰紫芝为半圆形，其余均为肾形。菌柄长达到4 cm 以上的菌株有农芝1 号、美国灵芝、大红芝，最长的是农芝1 号，达4.73 cm。菌盖宽达到8 cm 以上的菌株有农芝1 号、日本灵芝、大红芝，最宽的是农芝1 号，达9.17 cm。菌盖厚达到1 cm 以上的菌株有农芝1 号、日本灵芝、荷兰紫芝、大红芝，最厚的是大红芝，达1.27 cm。在色泽上，荷兰紫芝为紫黑色，其余均为黄褐色，农芝1 号、大红芝色泽最鲜艳（图5、6），其余次之。在分枝量上，韩国灵芝、荷兰紫芝最多，其次为日本灵芝、大红芝，农芝1 号、美国灵芝较少。在孢子量上，日本灵芝、美国灵芝最多，其次为农芝1 号、韩国灵芝、大红芝，荷兰紫芝最少。

表7 不同灵芝菌株子实体形态特征比较

2.3 不同灵芝菌株生物学效率及活性成分比较

从表8 可知，农芝1 号在枇杷枝屑（配方B）、杂木屑（配方A）上的产量、品质有所差异，配方B 的生物学效率和多糖、三萜含量均高于配方A，生物学效率高0.32%，多糖含量高0.22%，三萜含量高0.25%。

表8 不同灵芝菌株生物学效率及活性成分比较

供试灵芝菌株在枇杷枝屑（配方B）上的产量、品质也有所差异。在生物学效率上，大红芝最高，为8.60%；其次是农芝1 号，为7.56%；美国灵芝最低，为3.67%。在多糖含量上，大红芝最高，为 7.42 mg/g，其次是农芝 1 号，为6.68 mg/g；日本灵芝最低，为4.88 mg/g。在三萜含量上，大红芝最高，为9.60 mg/g；其次是农芝1 号，为9.27 mg/g；荷兰紫芝最低，为6.51 mg/g。

3 讨论与结论

试验中发现，农芝1 号在枇杷枝屑（配方B）的生物学效率和多糖、三萜含量均高于杂木屑（配方A），生物学效率高0.32%，多糖含量高0.22%，三萜含量高0.25%，表明利用枇杷枝屑作为培养基栽培灵芝能提高灵芝的产量和品质，这与文献[13-14]报道的相一致。

在不同营养对农芝1 号菌丝的影响试验中，添加枇杷枝屑的配方②④较未加枇杷枝屑的配方①③菌丝长势好、长速快，表明枇杷枝屑有利于农芝1 号菌丝的生长，这与文献[14-15]报道的相一致，具体是何种物质促进菌丝的生长，有待进一步研究。

同时，农芝1 号菌丝生长环境偏酸性，适宜pH 为6.0～6.5，这与文献[16]报道的枇杷树种植土壤以微酸性为最佳（土壤pH 6.0～6.5）相一致，表明农芝1 号对枇杷枝屑产生了一定的适应性，枇杷树适宜酸性土壤。

试验中发现，供试灵芝菌株的第1 潮子实体分枝量较少，而第2 潮子实体的分枝量较多，究其原因，应是袋子开口的问题，因此在栽培灵芝时，应根据市场需求选择是否袋子开口。

在子实体生长期间，给以一定的通风量，子实体均不形成鹿角状，而是形成片状；而通风量过小时，子实体不开片，呈鹿角状。因此在栽培过程中，应加强管理，注意调整通风量，以栽培出商品性状较好的灵芝子实体[17]。

内转录间隔区（internal transcribed spacer，ITS）序列为高度可变区，进化速度最快，能够承受更多的变异，因此利用ITS 序列研究种的分类阶元，其分子鉴定的结果可信，而ITS-RFLP 酶切片段是固定的，结果更可靠[18-19]。解凡等[8]、赵丽丽等[20]、邹莉等[21]采用ITS 测序比对、ITS-RFLP 分子标记等技术手段对野生灵芝进行鉴定，对于农芝1 号是否为新菌株，可采用ITS 测序、ITS-RFLP分子标记等技术手段对其作进一步鉴定。

生物学特性研究结果表明：农芝1 号菌丝生长适宜温度为25～30℃，适宜湿度为62%～63%，适宜pH 为6.0～6.5。当温度为5℃时，菌丝不萌发，转移至温度25℃培养时，菌丝开始萌发且生长良好，表明可采用冰箱4℃低温保藏菌种。

栽培特性比较研究结果表明：农芝1 号菌丝4 d 盖面，37 d 满袋，菌丝长速为0.441 cm/d；39 d原基形成，55 d 原基分化，75 d 孢子弹射，91 d可采收第1 潮；肾形，菌柄长4.73 cm，菌盖宽9.17 cm，菌盖厚1.19 cm；色泽鲜艳，第1 潮灵芝分枝较少，孢子量较多；2 潮干芝总单重29.11 g，生物学效率7.56%，多糖含量6.68 mg/g，三萜含量9.27 mg/g。第2 潮灵芝分枝多，色泽鲜艳，适合灵芝盆景制作。

在发菌情况上，日本灵芝、美国灵芝、大红芝较好，其次为农芝1 号、韩国灵芝，荷兰紫芝相对较差。在出芝时间上，农芝1 号、日本灵芝、大红芝较早；其次为韩国灵芝、荷兰紫芝，美国灵芝相对较迟。在芝形上，农芝1 号、大红芝较好，其次为日本灵芝、荷兰紫芝，韩国灵芝、美国灵芝相对较差；在孢子量上，日本灵芝、美国灵芝最多，其次为农芝1 号、韩国灵芝、大红芝，荷兰紫芝最少。在产量上，大红芝最高，其次为农芝1 号，美国灵芝最低。在多糖含量上，大红芝最高，其次为农芝1 号，日本灵芝最低。在三萜含量上，大红芝最高；其次为农芝1 号，荷兰紫芝最低。

在出芝栽培试验和栽培比较试验中，农芝1号发菌情况、出芝时间、芝形、孢子量、产量及多糖、三萜含量等方面相差不大，且驯化栽培的子实体形态与野生灵芝基本相同，说明农芝1 号具有稳定的遗传性。

综上所述，农芝1 号在菌丝生长周期、子实体性状及多糖、三萜含量等综合评价指标上，表现出菌丝生长较快、出芝较早、芝形较好、孢子量较多、产量较高及多糖、三萜含量较高等良好性状，该菌株既适合药用栽培又适合培育盆景，且遗传性稳定。因此，农芝1 号是适合栽培的优良菌株，具有潜在的开发利用价值，可用于进一步推广栽培。