某院耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌的临床特征及耐药基因分析

陈淑娟 曾建英 胡丽娟

肠杆菌科细菌可引起呼吸道感染、败血症、泌尿系感染等，碳青霉烯类药物因不良反应少、抗菌谱广、抗菌活性强等优点，在治疗多重耐药肠杆菌科细菌中应用广泛[1]。但因产超广谱β-内酰胺酶（extended-spectrum β-lactamase，ESBLs）的肠杆菌科细菌传播，大量应用碳青霉烯类药物，引起耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌（carbapenem resistant Enterobacteriaceae，CRE）的出现和流行，并因治疗方式有限、传播迅速的特点，导致发病率及病死率较高，增加医院治疗及防控的难度[2-3]。研究指出，耐药酶的产生、靶点的改变等方面是CRE的耐药机制，碳青霉烯酶为最主要耐药机制[4]。基于此，本研究分析CRE的临床特点及耐药基因，以指导临床治疗方案的拟定，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2019年1月-2021年12月莆田学院附属医院分离出的285株CRE。纳入标准：所有标本分离所得均按照《全国临床检验操作规程》执行[5]；菌株由痰液、尿液及血液等分离出。排除标准：同一患者同一部位相同的菌株。本院医学伦理委员会已审核本研究方案，并批准实施。

1.2 方法

1.2.1 细菌鉴定及药敏试验 按照文献[5]标准，药敏试验及细菌鉴定采用VITEK-2全自动微生物分析仪（法国生物梅里埃公司），采用英国OXOID纸片行扩散法进行复核，参照美国临床和试验标准化协会（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）2012版标准对药敏试验结果进行判定[6]。质控菌株为金黄色葡萄球菌ATCC25923、大肠埃希菌ATCC25922及铜绿假单胞菌ATC27853。

1.2.2 改良碳青霉烯灭活（modified carbapenem inactivation method，mCIM） 取接种环的过夜培养纯菌落（1 μl），在 2 ml胰蛋白胨大豆肉汤（tryptic soy broth，TSB）中，每管放美罗培南纸片（1张），（35±2）℃孵育 4 h±15 min，制备大肠埃希菌ATCC25922菌悬液（0.5麦氏浊度），对MH平板进行涂布，干燥5 min；取出TSB中美罗培南纸片，贴于 MH 平板上，（35±2）℃培养18～24 h，对抑菌圈直径进行测量，碳青霉烯酶阳性为美罗培南抑菌圈直径（16～18 mm 或 6～15 mm），抑菌圈内有可见散在菌落。

1.2.3 耐药基因检测 根据试剂盒说明书制备细菌的DNA的模板，以聚合酶链反应（PCR）的方式，针对12种酶（GES、KPC、NDM、SEM、NMC、VIM、GIM、OXA、SIM、IMI、SPM及IMP），合成引物，对所有引物采用比对搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）进行验证，目的条带采用对琼脂糖凝胶电泳法扩增阳性产物进行确定，并进行耐药基因测序，经过GenBank在线数据库比对耐药基因测序结果，并分析耐药基因型别。

1.3 观察指标

分析285株CRE菌株分布情况、标本来源、科室分布情况及耐药基因，并对肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌进行耐药性分析。

1.4 统计学处理

采用EXCEL进行全部数据相关指标计算及统计分析，计数资料以率（%）表示，对285株CRE临床特征及耐药基因进行分析。

2 结果

2.1 285株CRE菌株分布情况

285株CRE中主要为肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌，占比分别为83.16%、8.42%，见表1。

表1 285株CRE菌株分布情况

2.2 285株CRE标本来源

285株CRE标本主要来源于痰液、尿液、血液，占比分别为47.02%、23.86%、9.47%，见表2。

表2 285株CRE标本来源

2.3 285株CRE科室分布情况

285株CRE标本主要来源于ICU、呼吸科，占比分别为65.96%、15.79%，见表3。

表3 285株CRE科室分布情况

2.4 肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌株耐药性分析

肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌对头孢唑林、阿莫西林克拉维酸钾、头孢他啶、哌拉西林钠他唑巴坦、头孢曲松、头孢吡肟、氨苄西林钠舒巴坦钠、亚胺培南及美罗培南等耐药率达95.00%以上，环丙沙星及左氧氟沙星等耐药率达90.00%以上，对替加环素较敏感，见表4。

表4 237株肺炎克雷伯菌和24株大肠埃希菌耐药性分析

2.5 285株CRE耐药基因分析

285株CRE中有268株检出耐药基因，经BLAST比对得出，209株携带BlaKPC-2型基因，占比为73.33%，12株携带BlaKPC-19型基因，占比为4.21%，26株携带BlaNDM-1型基因，占比为9.12%，21株携带BlaNDM-5型基因，占比为7.37%，CRE肺炎克雷伯菌主要携带BlaKPC-2型基因，CRE大肠埃希菌主要携带BlaNDM-5型基因，见表5。

表5 285株CRE耐药基因分析[例（%）]

3 讨论

多重耐药或泛耐药是CRE引起的耐药特征，引起的感染治疗较为困难，严重可导致死亡，且目前，CRE存在散发、爆发流行的趋势，严重威胁公共卫生安全。因此，有必要对CRE的临床特征及耐药基因进行分析，以指导临床治疗方案的拟定。既往研究指出，CRE主要以肺炎克雷伯菌及大肠埃希菌为主[7]。本研究结果显示，285株CRE中主要为肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌，占比分别为83.16%、8.42%。与上述研究结果相似，分析原因可能为呼吸道标本的送检量较大，而呼吸道的主要病原菌为肺炎克雷伯菌；或可能因多数患者的疾病较为严重，身体抵抗力较差，为肺炎克雷伯菌的定植提供条件。

临床特征方面，本研究结果显示，285株CRE标本主要来源于痰液、尿液、血液，占比分别为47.02%、23.86%、9.47%。285株CRE标本主要来源于ICU、呼吸科，占比分别为65.96%、15.79%。说明CRE分布较为广泛，主要来源于痰液、尿液，分布于ICU及呼吸科。分析原因：痰液、尿液样本占比较多，可能与本院的样本结构有关，而ICU患者多合并严重的基础疾病，且多存在多发部位感染的倾向，使用的抗菌药物周期长及频率高，且多进行有创操作治疗，导致ICU中CRE检出较多[8]。而呼吸科疾病患者病情较为反复，患者普遍存在免疫力低下、住院时间长且频率高，增加CRE定植、感染的概率，导致呼吸科中CRE检出较多[9]。

产碳青霉烯酶是碳青霉烯类抗生素耐药主要机制，因其编码基因大都位于可转移元件如质粒或转座子上，在不同菌种菌属间均可传播[10]。本研究结果显示，肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌对头孢唑林、阿莫西林克拉维酸钾、头孢他啶、哌拉西林钠他唑巴坦、头孢曲松、头孢吡肟、氨苄西林钠舒巴坦钠、亚胺培南及美罗培南等耐药率达95.00%以上，环丙沙星及左氧氟沙星等耐药率达90.00%以上，对替加环素较敏感。本研究中，大肠埃希菌对氨曲南和替加环素比较敏感，耐药率分别为37.50%、0。金属酶不能将氨曲南水解，如药敏提示氨曲南敏感，而其他β-内酰胺类抗生素高度耐药时，提示产金属酶。CRE有高耐药性特点，CRE耐药性高可能是因为产碳青霉烯酶水解碳青霉烯类药物，大幅降低治疗效果。由于CRE治疗药物有限，应尽可能根据感染部位结合药敏结果，以选择最佳的抗菌治疗方案。

在耐药基因方面，王芳等[11]对成都中医药大学附属医院101株CRE进行分析，其中检测出耐药基因92株，占比为91.01%，测序结果提示，CRE肺炎克雷伯菌主要携带BlaKPC-2型基因，占比为82.43%，CRE大肠埃希菌主要携带BlaNDM-5型基因，占比为86.67%。本研究结果显示，285株CRE中有268株检出耐药基因，经BLAST比对得出，209株携带BlaKPC-2型基因，占比为73.33%，12株携带BlaKPC-19型基因，占比为4.21%，26株携带BlaNDM-1型基因，占比为9.12%，21株携带BlaNDM-5型基因，占比为7.37%，CRE肺炎克雷伯菌主要携带BlaKPC-2型基因，占比为83.97%，CRE大肠埃希菌主要携带BlaNDM-5型基因，占比为87.50%。较上述研究结果相似，以携带BlaNDM-5型基因的大肠埃希菌及BlaKPC-2型基因的肺炎克雷伯菌为主。碳青霉烯酶主要为A类KPC及B类NDM，均可由质粒介导产KPC、NDM型耐药基因，通过菌株自身克隆，或以不同菌种间水平转移方式，引起耐药菌株传播[12]。

综上所述，CRE有高耐药性特点，且在临床分布较为广泛，来源较广，同时CRE以携带BlaNDM-5型基因的大肠埃希菌及BlaKPC-2型基因的肺炎克雷伯菌为主，应对CRE感染，个体应开展耐药基因及耐药性的检测，以帮助临床医师选择治疗方案，减少细菌耐药，增强临床治疗效果。