双黄连注射剂中异绿原酸C致敏兔抗体效价测定

邓颖颖，徐丽婷，赵晓佳，张恩户，陈世忠

（1.陕西省西安国际医学中心医院药学部，西安 710100；2.陕西中医药大学药理教研室，咸阳 712046；3.北京大学药学院天然药物学系，北京 100083）

双黄连注射剂的主要组成成分为金银花、黄芩、连翘，具有抑菌、抗炎等药理作用，临床用于外感风热所致发热、咳嗽等疾病的治疗[1-5]。然而，随着临床的广泛应用，有关其不良反应的报道也随之增多。崔盈盈等[6]应用关联规则Apriori算法发现，患者在使用双黄连注射剂后不良反应发生率占比约为5.62%。马婷[7]对辽宁某医院254例中药不良反应病例做了调查报道，发现病例所累及的器官、系统中以皮肤损害最为常见，占比高达53.87%，共计146例，临床表现多为皮疹、瘙痒等。双黄连注射剂组成成分复杂，导致过敏反应的具体成分至今尚不明确，有研究[8]指出，致敏成分的存在，是引起过敏反应的主要原因之一。北京大学陈世忠教授团队采用“在线化合物-牛血清白蛋白（BSA）荧光检测活性筛选”系统对双黄连注射剂中的化合物进行在线BSA结合活性筛选，通过对结合常数、结合位点、化合物与BSA结合强度等的测定和计算，分析出异绿原酸C具有疑似半抗原活性。本实验是在体外制得异绿原酸C抗血清，模拟双黄连注射剂进入家兔体内的致敏过程。运用ELISA法检测原理考证双黄连注射剂中疑似半抗原物质异绿原酸C是否具有致敏性。

1 资料与方法

1.1 材料

1.1.1 仪器与试剂 酶标仪（美国BioTek公司，型号Synergy LX）；异绿原酸C（中国科学院成都生物研究所，生产批号：MUST-14111414）；金黄色葡萄球菌细胞壁蛋白A交联的辣根过氧化物酶（HRP-SPA，北京博尔西科技有限公司，GP：2020.11.02）；弗氏佐剂（美国SIGMA公司，10 mL，SLBD0736）；兔免疫球蛋白E（IgE）ELISA试剂盒（上海酶联生物科技有限公司，GP：2020.12.30）；牛血清白蛋白（BSA，上海顺勃生物工程技术有限公司，GP：2020.11.28）等。

1.1.2 实验动物 第四军医大学实验动物中心提供的体质量在2.5～3.5 kg的普通级雄性新西兰白兔，实验动物质量合格证号：No.61000400000021，生产许可证号：SCXK（军）20120007。动物分笼饲养，保持12 h昼夜节律，自由饮水摄食。

1.2 实验方法

1.2.1 异绿原酸C-血浆蛋白全抗原的制备 制备致敏前血清，先将家兔置于兔固定桶内固定，用乙醇擦拭耳朵，使其上的动脉扩张、清晰，采血10 mL。精密称取2 mg的异绿原酸C，用0.6 mL生理盐水将其溶解，制成每毫升生理盐水含有3.3 mg异绿原酸C的溶液，将0.4 mL的致敏前血清与配制好的异绿原酸C溶液混合，37℃温育2 h，然后将温育后的溶液与1 mL弗氏佐剂用漩涡混合器震荡，使其充分乳化混合。

1.2.2 异绿原酸C特异性抗体的测定 对家兔首次免疫使用的是现制备好的抗原液，用剃毛机将距离兔子背部脊柱线3 cm处的毛发处理干净，露出粉色皮肤，事先在脊柱两侧用标记笔每隔2 cm均匀地标记10个点，然后用注射器在标记处每点注射0.2 mL抗原液，注射完成后皮肤处有皮丘出现则代表免疫成功，第2天发现，家兔皮肤表面皮丘转变为结痂，随着时间的更迭，家兔皮肤逐渐恢复。10 d以后，对家兔进行加强免疫，使用与首次免疫剂量相同的弗氏不完全佐剂乳化的抗原液，之后每间隔1周对家兔进行1次加强免疫，加强免疫进行5次后，间隔7 d时间，麻醉家兔进行手术，用注射器自其腹主动脉采血，高速离心机分离全血，取上清液即制得异绿原酸C-血浆蛋白全抗原的抗血清。

1.2.3 试剂的配制1）制备Na2CO3缓冲溶液：取1.465 g Na2CO3和0.795 g NaHCO3置于50 mL量瓶中，用双蒸水将其完全溶解并定容至刻度处；2）制备2%BSA液：取一个50 mL量瓶，称取1 g BSA置于其中，用浓度为0.15 mol·L-1pH 7.4的磷酸盐缓冲液（PBS）将其溶解并定容至刻度处；3）制备磷酸盐吐温缓冲液（PBST）：取一个100 mL量瓶，量取0.05 mL Tween20置于其中，用浓度为0.15 mol·L-1pH 7.4的PBS将其溶解并定容至刻度处；4）制备HRP-SPA、底物液、终止液。

1.2.4 抗体效价的检测方法[9]1）包被：将异绿原酸C-血浆蛋白全抗原用Na2CO3缓冲液稀释4倍作为包被原，取一块96孔板，将制备好的包被原用移液枪每孔滴加110 μL，置于冰箱4℃温度中包被过夜，取出96孔板，甩尽孔内的液体，然后用PBST洗涤，3次/4 min，每孔滴加2%BSA 130 μL，置于4℃冰箱中封闭过夜；2）加抗血清：洗涤结束后，每孔加入抗血清100 μL（用0.15 mol·L-1pH 7.4的PBS按1∶1～1∶128的比例逐倍稀释），37℃温育2 h；3）加酶标二抗：洗涤结束后，每孔加入100 μL HRP-SPA，37℃水预锅内孵育1 h；4）显色、终止、测定；5）判定：加致敏前血清的孔设置为阴性对照孔，不加血清的孔设置为空白对照孔，每个样品设置5个平行对照孔，阳性的评判准则为：相对于阴性对照孔OD≥2倍。

1.2.5 间接竞争ELISA测定抗体特异性 每孔滴加1 mg·mL-1的异绿原酸C-血浆蛋白110 μL作为包被原，封闭洗涤，用0.9%的NaCl2溶液将配制好的4 mg·mL-1的异绿原酸C溶液逐倍稀释至0.25 mg·mL-1，然后将稀释后的不同浓度溶液每孔加入50 μL，每孔再加入按1∶1稀释的抗血清100 μL，37℃孵育2 h；洗涤3次结束后，每孔加入100 μL按1∶200稀释的酶标抗体HRPSPA，37℃孵育1 h；洗涤、显色、终止、测定。加稀释液的孔设置为阳性对照孔，不加异绿原酸C的孔设置为阴性对照孔，并设置5个平行对照孔。应用公式I=（阴性对照孔OD－样品OD）/（阴性对照孔OD－阳性对照孔OD）×100%[10]计算异绿原酸C的抑制率I（%）。绘制抑制曲线的依据是，取异绿原酸C浓度的对数值作为横坐标，抑制率作为纵坐标。通过回归分析，建立回归方程并计算相关系数R2、IC5（0即指抑制率为50%时所对应的异绿原酸C浓度）、检测限（IC10）。

1.2.6 测定IgE型抗体浓度 本实验中，家兔IgE的水平由IgE ELISA试剂盒测定所得，详细操作依据说明书步骤进行。

1.3 统计学方法

采用SPSS 17.0统计学软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用t检验。P≤0.01为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 兔抗异绿原酸C抗血清的效价测定

将兔抗异绿原酸C抗血清按1∶1逐倍稀释至1∶128，结果仍显示为阳性，说明外源性的抗体在家兔血清中已经产生。将稀释后的各组兔抗异绿原酸C血清抗体效价值与致敏前血清效价（OD值）进行比较，差异均有统计学意义（P均＜0.01），从结果分析中得出，异绿原酸C具有致敏性，见表1。

2.2 间接竞争ELISA结果

2.2.1 建立回归方程I=0.430 lgC+0.319，R2=0.997，半数抑制浓度IC50=2.628 mg·mL-1，IC10=0.309 mg·mL-1，见图1。异绿原酸C随着浓度的增大对抗血清的抑制率逐渐升高，提示抗血清中的抗体是针对该药物产生的，具有特异性，见表2、图1。

图1 异绿原酸C抑制率曲线

表1兔抗异绿原酸C血清效价测定（±s）

表1兔抗异绿原酸C血清效价测定（±s）

*为与致敏前血清效价（OD值）比较。

组别 n 效价（OD值） t值* P值*致敏前血清 异绿原酸C抗血清1∶1稀释 异绿原酸C抗血清1∶2稀释 异绿原酸C抗血清1∶4稀释 5 0.136±0.010兔抗5 0.856±0.030 49.803 ＜0.01兔抗5 0.769±0.020 56.891 ＜0.01兔抗5 0.757±0.020 58.415 ＜0.01兔抗异绿原酸C抗血清1∶8稀释 5 0.725±0.010 81.680 ＜0.01兔抗异绿原酸C抗血清1∶16稀释 5 0.639±0.010 61.635 ＜0.01兔抗异绿原酸C抗血清1∶32稀释 5 0.571±0.020 41.264 ＜0.01兔抗异绿原酸C抗血清1∶64稀释 5 0.535±0.010 52.265 ＜0.01兔抗异绿原酸C抗血清1∶128稀释 5 0.524±0.010 54.003 ＜0.01

表2异绿原酸C对抗血清的特异性研究（±s）

表2异绿原酸C对抗血清的特异性研究（±s）

组别 n 效价（OD值） I/%空白对照 5 0.125±0.010 100.00异绿原酸C浓度/（mg·mL-1） 0.00 5 0.402±0.030 0.00 0.25 5 0.386±0.010 5.78 0.50 5 0.349±0.020 18.84 1.00 5 0.313±0.010 32.18 2.00 5 0.273±0.020 46.57 3.00 5 0.261±0.010 52.22 4.00 5 0.245±0.020 56.64?

2.2.2 依据回归方程计算样本对应的IgE型抗体浓度 通过回归分析，建立曲线方程：Y=1.849X2+13.344X-0.308，R2=0.999，其中X代表效价（OD值），Y代表对应IgE型抗体浓度。空白组效价（OD值）为0.172，IgE型抗体浓度为2.038 μg·mL-1，异绿原酸C组效价（OD值）为0.398，IgE型抗体浓度为5.295 μg·mL-1，依据IgE型抗体浓度提高率=（C-C空白）/C空白，C空白代表未经过免疫的正常家兔血清检测出的浓度值，C代表异绿原酸C抗血清中IgE型抗体的浓度，计算得出，提高率达159.81%。

3 讨论

中药有组成成分复杂，致敏成分不确切，致敏机制不同的特性[11-12]。中药注射剂的有效成分通常为小分子物质而不具有免疫原性，但可能与体内的活性代谢产物蛋白质结合而形成超分子化合物，直接或通过药物代谢酶分解后与蛋白类载体连接形成载体复合物-超分子半抗原，进而通过抗原处理、提呈及免疫细胞的识别、增殖和反应等一系列机制诱发免疫应答发生[13]，本实验应用该原理在体外制得异绿原酸C抗血清，模拟双黄连注射剂进入家兔体内所发生的一系列致敏过程，结果表明，异绿原酸C的抗体效价高于致敏前血清OD值的2倍，说明异绿原酸C有潜在的致敏性。间接竞争ELISA法测定抗体特异性结果表明，异绿原酸C免疫后的家兔抗血清中的抗体具有一定的特异性。IgE型抗体浓度的测定结果表明，经过多次免疫后的家兔体内产生了外源性IgE型抗体。综上所述，在本实验条件下双黄连注射剂中疑似半抗原物质异绿原酸C具有致敏性。运用ELISA法具有一定的通用性和可操作性，为日后研究双黄连注射剂中的致敏成分提供了借鉴方法。