常用补血中药对于血虚证的影响

王芳 马威

血虚证是中医临床常见证候，主要是由于血液生化不足及血液耗损过多而致血液亏虚，不能濡养脏腑、经络、组织，是以面、睑、唇、舌色淡白，脉细为主要临床表现的一系列虚弱表现证候的总称，涉及心、肺、肝、脾、肾等脏器，可见于临床各种慢性疾病的辨证中，如冠心病、各种贫血、糖尿病、慢性肾脏疾病后期、脑梗死后遗症等多种疾病。依据虚者补之的原则，临床又有益气补血，滋阴补血、补血活血等不同治则，补血作用的药物和处方也多，如四物汤、炙甘草汤、当归生姜羊肉汤、小建中汤等；而药物则更加繁多。如何选择用药，以发挥较好或者更佳疗效，对临床医师来说是一个需要思考且亟待解决的问题。故笔者选择了临床常用的多味补血中药，从补血的作用出发，探讨这些中药在补血方面的功效优劣，并探讨其作用机制，为临床用药和中医理论的发展提供一个思路。

1 材料与方法

1.1 一般材料

SPF级120只4周龄KM小鼠，雄性，22～25 g，购于湖北省实验动物中心，动物合格证号：No.00017793。本动物实验方案经武汉市中西医结合医院动物中心进行动物实验伦理审查合格（且取材前动物须经腹腔注射戊巴比妥麻醉）。动物实验完成于武汉市中西医结合医院SPF动物室，实验动物设施使用证号：No.00022894。

1.2 方法

1.2.1 实验试剂 小鼠促红细胞生成素（erythropoietin，EPO）ELISA Kit，武汉博士德（EK0333）白细胞介素-3（IL-3）ELISA Kit，武汉博士德（EK0403）。

1.2.2 实验设备 仪器设备血球分析仪Sysmex-2000iV（Sysmex Corporation，日本）。

1.2.3 实验药物 中药阿胶、当归、白芍、大枣、丹参、制首乌、熟地、桑葚、龙眼肉等，均购自武汉市中西医结合医院，由湖北中医药大学药学院鉴定。分别取当归、白芍、大枣、丹参、制首乌、熟地、桑葚、龙眼肉各50 g于烧杯中，加去离子水120 ml，浸泡30 min；第一煎（大火煎开，转小火20 min，然后多层纱布过滤，滤液保留备用）；第二煎（第一煎之药渣中加入80 ml去离子水，大火煎开，转小火20 min，然后多层纱布过滤）；合并2次滤液，于小火上浓缩至83 ml（含生药浓度0.6 g/ml）。取阿胶50 g，隔水蒸至完全溶解，定容至83 ml（含生药浓度0.6 g/ml）。药物对照选择常用的补血剂四物汤（《太平惠民和剂局方》）：当归10 g，川芎8 g，白芍12 g，熟地12 g。加水100.8 ml浸泡后，按上述方法煎煮，最后浓缩至70 ml（含生药浓度0.6 g/ml）备用。

1.2.4 实验方法 （1）血虚模型[1]的建立：KM小鼠，适应性喂养1周后，经210 Gy60Co一次全身照射制备模型。（2）实验分组及干预治疗：120只KM小鼠，适应性喂养1周后，随机分为12组，分别为模型组、空白组、阿胶组、白芍组、大枣组、丹参组、当归组、龙眼肉组、熟地组、制首乌组、桑葚组及药物对照组，每组10只。实验第1天，上午各中药组及药物对照组分别灌胃各自中药[剂量为100 mg/（kg·d）]，模型组及空白组灌胃同等体积的蒸馏水；下午除空白组外，其他各组动物经210 Gy60Co一次全身照射造模。各组动物连续灌胃10 d。最后一次灌胃2 h后，各组动物腹腔注射戊巴比妥（50 mg/kg）麻醉，再采血、取肾组织标本备用。

1.3 观察指标及评价标准

1.3.1 比较各组体重、血红蛋白（Hb）、红细胞数量（RBC）、血细胞比容（HCT），均由仪器检测。

1.3.2 血清EPO、IL-3检测 比较12组血清EPO、IL-3水平，严格按说明书要求采用ELISA法检测EPO、IL-3含量（准备试剂和标准品；每孔添加100 μl样品和标准品，37 ℃反应90 min，不洗；每孔添加100 μl生物素标记抗体，37 ℃反应60 min；0.01 M TBS洗涤 3次；每孔添加 100 μl ABC，37 ℃反应30 min；0.01 M TBS洗涤5次；TMB 37 ℃避光反应30 min以内；加入TMB终止液，酶标仪上读数；绘制标准曲线并计算各样本含量）。

1.3.3 RT-PCR检测肾组织促红细胞生成素受体（EPOR）mRNA表达 比较各组肾组织EPOR mRNA表达水平，以Trizol提取总mRNA，逆转录后PCR扩增，扩增产物琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像分析仪上进行灰度（IOD）扫描分析，利用相应的β-actin灰度值为参照，以与其比值表示各组各指标mRNA表达的相对强弱。PCR扩增引物合成于上海生工公司，β-actin引物：上游5’-CACGATGGAGGGGCCGGACTCATC-3’，下 游5’-TAAAGACCTCTATGCCAACACAGT-3，产物长度240 bp，退火温度56 ℃，30个循环；EPOR引物：上游 5’- ACACTGGGGAGTGACTCAGG-3’，下游 5’-CATCCATAGTCGCAGGGTCT-3’，产物长度 180 bp，退火温度56 ℃，30个循环。

1.4 统计学处理

本研究数据采用SPSS 18.0统计学软件进行分析和处理，计量资料以（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，两组间比较采用LSD检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组体重、Hb、RBC、HCT比较

与空白组比较，模型组体重、HCT、Hb、RBC均较低（P=0.000）。与模型组比较，药物对照组体重、HCT、Hb、RBC均较高（P=0.000），各单味中药组（除桑葚组外）体重、HCT、Hb、RBC均较高（P<0.05）。与药物对照组比较，丹参组体重较低（P<0.05），其余各单味中药组与药物对照组体重、Hb、RBC、HCT比较差异无统计学意义（P>0.05），见表1。

表1 各组体重、Hb、RBC、HCT比较（±s）

表1 各组体重、Hb、RBC、HCT比较（±s）

*与空白组比较，P<0.01；#与模型组比较，P<0.05；△与模型组比较，P<0.01；▲与药物对照组比较，P<0.05。

组别 体重（g） HCT（%） Hb（g/L） RBC（×1012/L）空白组（n=10） 35.24±1.66 45.98±2.42 120.12±8.90 7.19±0.39模型组（n=10） 30.14±0.49* 36.60±3.14* 93.25±8.38* 5.53±0.49*药物对照组（n=10） 35.26±2.12△ 48.68±5.20△ 127.10±10.02△ 7.26±0.46△阿胶组（n=10） 33.33±3.18# 44.56±3.46△ 119.56±11.17△ 7.02±0.67△白芍组（n=10） 32.99±2.41# 47.22±3.07△ 124.11±7.90△ 7.38±0.57△大枣组（n=10） 33.59±2.31△ 48.43±2.95△ 126.22±8.14△ 7.50±0.50△丹参组（n=10） 32.99±1.64△▲ 46.07±2.37△ 117.22±9.04△ 7.13±0.50△当归组（n=10） 33.34±1.60△ 45.58±1.60△ 119.62±7.95△ 7.05±0.36△龙眼肉组（n=10） 34.19±2.28△ 43.89±3.42△ 112.71±9.86△ 6.69±0.50△桑葚组（n=10） 32.16±3.16 45.74±1.56△ 118.56±6.09△ 7.11±0.37△熟地组（n=10） 34.29±3.17△ 44.99±3.98△ 122.33±15.54△ 6.99±0.63△制首乌组（n=10） 30.84±1.90△ 46.72±2.80△ 120.44±6.04△ 7.39±0.38△F值 2.991 1.161 2.260 2.991 P值 0.004 0.338 0.026 0.004

2.2 各组血清EPO、IL-3水平比较

与空白组比较，模型组血清IL-3、EPO含量均高（P<0.05）。与模型组比较，阿胶、白芍、丹参、当归、龙眼肉、桑葚组血清IL-3含量均低（P<0.05），大枣、熟地、制首乌组虽低，但差异均无统计学意义（P>0.05）。与药物对照组比较，当归组血清IL-3含量低（P<0.05）。另外，与模型组比较，药物对照、阿胶、丹参、龙眼肉组血清EPO含量均低（P<0.05），白芍、桑葚、大枣、当归、熟地、制首乌组血清EPO含量与模型组比较差异无统计学意义（P>0.05）。与药物对照组比较，阿胶组血清EPO含量低（P<0.05），大枣、当归、熟地、制首乌组血清EPO含量均高（P<0.05），见表2。

表2 各组血清EPO、IL-3水平比较[pg/ml，（±s）]

表2 各组血清EPO、IL-3水平比较[pg/ml，（±s）]

*与空白组比较，P<0.05；#与模型组比较，P<0.05；△与模型组比较，P<0.01；▲与药物对照组比较，P<0.05；▽与药物对照组比较，P<0.01。

组别 IL-3 EPO空白组（n=10） 74.03±12.85 117.27±13.56模型组（n=10） 87.23±11.51* 131.27±11.41*药物对照组（n=10） 72.70±10.79# 118.01±5.20#阿胶组（n=10） 66.04±9.50△ 108.79±9.50#△▲白芍组（n=10） 62.22±9.60△ 119.23±12.80大枣组（n=10） 78.02±20.60 144.00±15.80▽丹参组（n=10） 71.05±8.90△ 101.72±21.37#△当归组（n=10） 51.80±21.88△▲ 143.62±18.97▽龙眼肉组（n=10） 62.62±13.22△ 112.07±15.74#桑葚组（n=10） 70.73±11.95#△ 124.52±12.26熟地组（n=10） 73.22±20.66 138.47±18.59▲▽制首乌组（n=10） 85.42±11.34 145.26±16.87▽F值 14.796 17.508 P值 0.000 0.000

2.3 各组肾组织EPOR mRNA表达比较

与空白组比较，模型组肾组织EPOR mRNA表达低（P<0.01）。与模型组比较，药物对照组、阿胶组、白芍组、大枣组、丹参组、当归组、龙眼肉组、桑葚组、熟地组、制首乌组肾组织EPOR mRNA表达均高（P<0.05）。与药物对照组比较，阿胶、白芍、当归、熟地、制首乌组肾组织EPOR mRNA表达低（P<0.05），大枣、丹参、龙眼肉、桑葚组肾组织EPOR mRNA表达比较差异无统计学意义（P>0.05），见表3、图1。

图1 12组肾组织EPOR mRNA表达比较

表3 各组肾组织EPOR mRNA表达比较（±s）

表3 各组肾组织EPOR mRNA表达比较（±s）

*与空白组比较，P<0.01；#与模型组比较，P<0.05；△与模型组比较，P<0.01；▲与药物对照组比较，P<0.01。

组别 EPOR mRNA空白组（n=10） 1.290±0.110模型组（n=10） 0.668±0.073*药物对照组（n=10） 1.205±0.113△阿胶组（n=10） 0.785±0.084#▲白芍组（n=10） 1.045±0.082△▲大枣组（n=10） 1.121±0.092△丹参组（n=10） 1.017±0.093△当归组（n=10） 0.775±0.065#▲龙眼肉组（n=10） 1.106±0.097△桑葚组（n=10） 1.084±0.113△熟地组（n=10） 0.917±0.083△▲制首乌组（n=10） 0.806±0.067△▲F值 13.521 P值 0.000

3 讨论

3.1 中药对贫血基本指标的影响

血虚证是血液亏虚，脏腑百脉失养，而表现全身虚弱的证候[2-3]。中医血虚证不单纯属某一疾病，而是表现于临床各科的多种疾病过程中，可见于现代医学的缺铁性贫血、再生障碍性贫血、溶血性贫血、白血病等各种失血疾病。临床主要表现为面色无华，口唇淡白，肌肤苍白灰暗；情志方面，容易惊惕不安，有莫可名状的恐惧感等；视力减弱，视物昏花，目不精明；女性可见月事渐少以致不来；脉见虚而无力之象。血虚主要有化源不足和失血过多两个方面造成，故虚者补之，治疗主要在于养血补血。目前临床各种原因所致贫血均可辨证归属血虚证，故笔者用单味药物治疗血虚证模型动物，观察不同单味补血中药的功效优劣及其对造血调控的影响。

中药学课本中记载补血药有白芍、熟地、制首乌、阿胶、当归、丹参、龙眼肉等，另外，在临床大枣与桑葚也常用于补血。这些常用中药虽然性味功效各有侧重，但均有补血作用。药典中记载，白芍，性微寒，味苦酸，平肝止痛，养血调经；阿胶，味甘，性平，归肺、肝、肾经，补血滋阴，润燥，止血；大枣，味甘性温，补中益气，养血安神；丹参，味苦，微寒，归心肝经，活血祛瘀，通经止痛，清心除烦，凉血消痈；当归，甘，辛，温，归肝、心、脾经，补血活血，调经止痛，润肠通便；龙眼肉，甘，温，归心、脾经，补益心脾，养血安神；桑葚，甘，酸，寒，归心、肝、肾经，滋阴补血，生精润燥；熟地，甘，微温，归肝、肾经，补血滋阴，益精添髓；制首乌，苦，甘，涩，微温，归肝、心、肾经，补肝肾，益精血，乌须发，强筋骨，化浊降脂。丹参、当归，活血补血；阿胶、白芍、熟地、桑葚、制首乌，滋阴补血；大枣补血和中；龙眼肉补心养血。以上诸药，均可补血，用于血虚证的治疗。

实验结果提示，与模型组比较，药物对照组体重、HCT、Hb、RBC均较高（P=0.000），各单味中药组（除桑葚组外）体重、HCT、Hb、RBC均较高（P<0.05），表明，四物汤及白芍、阿胶、丹参、大枣、当归、龙眼肉、桑葚、熟地、制首乌中药组均可改善小鼠贫血。与药物对照组比较，丹参组体重较低（P<0.05），其他各单味中药组体重、HCT、Hb、RBC与药物对照组比较差异无统计学意义（P>0.05）。本实验结果与既往研究报道文献[4-10]结果一致，均提示常用中药白芍、熟地、大枣、当归、制首乌等可改善贫血。

补血药物从血红蛋白均值水平来推断，功效由强到弱依次为大枣>白芍>熟地>制首乌>当归>阿胶>桑葚>丹参>龙眼肉。上述中药均可补血，白芍、熟地、制首乌益肾补血作用最强；阿胶、当归、丹参、桑葚临床最为常用，作用平和；大枣调和诸药，实验中功效位列首位，可能与其剂量有关，其临床应用广泛，通常剂量轻微，主要作为佐药应用，大枣重用主要在于补血[7]；龙眼肉主要滋阴补血，补血力量最弱。

血虚证产生原因包括有外感六淫、内伤七情及瘀血，其均可导致内血耗损而血虚，与心、肝、肾密切相关。除大枣外，制首乌补肾益精血，在常用补血药物中对红细胞的改善作用最为显著，数值最高。肾为先天之本，肾主骨生髓，肾精、肾气、肾阴、肾阳及津液在血液的生成中发挥重要作用，因此肾脏病变可影响血的生成而导致血虚证，提示临证治疗血虚证时可从肾脏论治：填精益髓以资血，补益肾气以养血，滋肾阴温肾阳以生血[11]。故实验结果提示制首乌补血效果较好。

3.2 对造血调控的影响

血虚是临床常见病症，多由于生血乏源、失血过多、肾精亏损、大病等引起，目前对血液症的研究主要集中于临床体征、血细胞功能、免疫功能、骨髓造血功能的改变等有关方面。放射损伤也是目前各种免疫抑制模型制备的方法之一，它可以使得免疫器官萎缩、抑制造血系统的功能。是目前建立血虚模型的主要方法之一。模型可以表现出贫血的基本特征，如红细胞减少、血红蛋白下降、血细胞比容降低等，贫血是判定血虚模型成功的主要指标。

中药改善贫血机制涉及造血调控的多个环节。EPO是红细胞生成的关键调节因子。肾脏的间质管周细胞（IPC）在成年期产生和分泌EPO。同时EPO作用于肽激素和造血生长因子（HGF），刺激骨髓红细胞生成。EPO的产生由缺氧激活，并通过氧敏感反馈回路进行调节。EPO通过其同型二聚体EPOR起作用，该受体可增加细胞存活率并驱动祖细胞BFU-E和CFU-E的终末红细胞成熟为数十亿成熟红细胞[12]。红细胞祖细胞（BFU-E/CFU-E）的体内生成基本上受多种因素控制，包括糖皮质激素、炎症和压力。此外，只有通过外部信号（如促红细胞生成素、SCF、IL-3和与细胞外基质蛋白的相互作用）协调调节红细胞祖细胞的终末增殖和分化，才能定期产生功能成熟/可输注的红细胞单位[13]。本实验中，与空白组比较，模型组血清IL-3、EPO含量均高（P<0.05），提示贫血刺激了IL-3、EPO的分泌。与模型组比较，阿胶、白芍、丹参、当归、龙眼肉、桑葚组血清IL-3含量均低（P<0.05），大枣、熟地、制首乌组虽有降低，但比较差异无统计学意义（P>0.05）。与药物对照组比较，当归组血清IL-3含量低（P<0.05）。提示各中药治疗组并没有增加IL-3的分泌。另外，与模型组比较，药物对照、阿胶、丹参、龙眼肉组血清EPO含量均低（P<0.05），白芍、桑葚、大枣、当归、熟地、制首乌组血清EPO含量与模型组比较差异无统计学意义（P>0.05）。与药物对照组比较，阿胶组血清EPO含量低（P<0.05），大枣、当归、熟地、制首乌组血清EPO含量高（P<0.05）。结果显示，各中药改善贫血并不是均可提高EPO、IL-3的分泌。与空白组比较，模型组肾组织EPOR mRNA表达低（P<0.01）。与模型组比较，药物对照组、阿胶组、白芍组、大枣组、丹参组、当归组、龙眼肉组、桑葚组、熟地组、制首乌组肾组织EPOR mRNA表达均高（P<0.05），提示，中药补血虽可刺激EPOR mRNA的表达，但EPO的表达与其并不一致，故作用并不是刺激EPO、IL-3的分泌，另有其他影响机制。

治疗时间短暂，可能是疗效不显著的原因之一；另外，各中药作用途径可能不同，本实验仅是一个探索。中药改善血虚作用机制复杂，中药剂量大小、作用时效等均会对其功效的发挥构成影响，其对造血调控的影响还需要进一步探索。