巴马汀对BRAF/KRAS突变非小细胞肺癌细胞增殖凋亡和顺铂敏感性的影响

黄 亮, 黄 旭, 张冠男

(1.承德医学院附属医院肿瘤科, 河北 承 德 067000 2.北京市大兴区中西医结合医院普胸外科， 北京 大兴区 100076)

肺癌是一类起源于支气管黏膜上皮或腺体的恶性肿瘤，已成为我国城乡居民因恶性肿瘤死亡原因的主要原因之一。非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)约占肺癌患者总数的80%～85%，也是临床上最常见的肺癌类型[1]。鼠类肉瘤病毒癌基因同源物B1(V-raf murine sarcoma viral oncogene homolog B1,BRAF)基因和Kirsten大鼠肉瘤病毒基因同源物(Kirsten rat sarcoma viral oncogene,KRAS)基因是NSCLC的主要驱动基因，二者发生突变的检出率分别为15%～25%和0.5%～4.9%[2]。研究表明，BRAF突变和KRAS突变可降低NSCLC细胞对铂类化疗药物的敏感性，严重影响NSCLC患者的化疗预后[3]。因此，开发针对BRAF/KRAS突变的治疗方案显得尤为重要。巴马汀属于季铵盐异喹啉类生物碱，最初由防己科植物黄藤的干燥藤茎中提取。研究表明，巴马汀具有多种药理学效应，包括促炎症消退、抗氧化、抗细菌和抗病毒作用[4]。近年来，众多研究者发现，巴马汀可选择性抑制肿瘤细胞的增殖、促进肿瘤细胞的凋亡，而不影响正常组织[4,5]。因此，本研究旨在探讨巴马汀对BRAF/KRAS双突变NSCLC细胞增殖、凋亡和顺铂化疗敏感性的影响，以期为临床治疗NSCLC提供理论依据。

1 材料与方法

1.1实验材料:人BRAF/KRAS双突变NSCLC细胞株A549购自上海博谷生物科技有限公司。巴马汀和顺铂购自美国Sigma公司。胎牛血清和RPMI1640培养基均购自美国Gibco公司。噻唑蓝(MTT)检测试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司。凋亡试剂盒和流式细胞仪均购自美国BD公司。B细胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)、聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(PARP)抗体和α-微管蛋白(α-tubulin)抗体均购自美国abcam公司。

1.2细胞培养、分组与处理:取出冻存的A549细胞，经复苏后接种于含10%胎牛血清的RPMI1640培养基中，在98%湿度、5% CO2和37℃条件下培养。待细胞处于对数增殖期时，将其接种于96孔板。在第一部分研究中，将A549细胞分为4组：①对照组：不加任何药物处理A549细胞48h；②1μmoL/L组：加入1μmoL/L巴马汀处理A549细胞48h；③5μmoL/L组：加入5μmoL/L巴马汀处理A549细胞48h；④10μmoL/L组：加入10μmoL/L巴马汀处理A549细胞48h；在第二部分研究中，将A549细胞分为4组：①对照组：不加任何药物处理A549细胞48h；②巴马汀组：加入10μmoL/L巴马汀处理A549细胞48h；③顺铂组：加入6μmoL/L顺铂处理A549细胞48h；④顺铂+巴马汀组：分别加入6μmoL/L顺铂和10μmoL/L巴马汀处理A549细胞48h。

1.3细胞活力检测:弃去培养液，加入PBS溶液冲洗，每孔加入20μL MTT溶液，将96孔板置于培养箱中孵育3h。弃去上清液，每孔加入150μL二甲基亚砜溶液，轻轻晃动96孔板，使结晶充分溶解。将96孔板置于酶标仪中，检测各组细胞在490nm处的吸光度值(OD值)。细胞活力(%)=(加药孔OD值-空白孔OD值)/(对照孔OD值-空白孔OD值)×100%。实验重复3次。

1.4流式细胞术检测:弃去培养液，加入PBS溶液冲洗并收集A549细胞。将离心管置于离心机中，2500r/min离心5min，弃去上清液，加入100μL的1×结合缓冲液以重悬细胞。分别加入5μL Annexin V-FITC溶液和5μL PI溶液，37℃避光孵育10min，将细胞置于流式细胞仪中，检测各组细胞的凋亡率。实验重复3次。

1.5Western blotting检测:利用蛋白提取试剂盒提取细胞总蛋白，蛋白定量后进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳。电泳结束后，将蛋白转移至PVDF膜中，5%脱脂奶粉室温封闭1h，TBST洗膜3次。将PVDF膜分别放入Bcl-2、PARP和α-tubulin抗体中，4℃孵育过夜，漂洗后加入适量的二抗，室温孵育1h，利用Odyssey凝胶成像系统进行灰度分析。以α-tubulin为内参，分析Bcl-2和PARP蛋白表达水平，实验重复3次。

1.6统计学方法:利用SPSS21.0软件进行统计学分析。计量数据以均数±标准差表示，两组数据比较采用t检验，多组间数据比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD法。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1不同浓度巴马汀对细胞活力的影响:与对照组比较，1μmoL/L、5μmoL/L和10μmoL/L组细胞的增殖活力显著降低，差异有统计学意义(F=114.647,P<0.05)；与1μmoL/L组比较，5μmoL/L和10μmoL/L组细胞的增殖活力均显著降低，差异有统计学意义(F=87.179,P<0.05)；与5μmoL/L组比较，10μmoL/L组细胞的增殖活力显著降低，差异有统计学意义(t=7.667,P<0.05)。见图1。

2.2不同浓度巴马汀对细胞凋亡的影响:与对照组比较，1μmoL/L、5μmoL/L和10μmoL/L组细胞的凋亡率显著升高，差异有统计学意义(F=56.119,P<0.05)；与1μmoL/L组比较，5μmoL/L和10μmoL/L组细胞的凋亡率均显著升高，差异有统计学意义(F=51.273,P<0.05)；与5μmoL/L组比较，10μmoL/L组细胞的凋亡率显著升高，差异有统计学意义(t=6.525,P<0.05)。见图2。

图2 不同浓度巴马汀对细胞凋亡的影响

2.3不同浓度巴马汀对细胞凋亡相关蛋白表达的影响:与对照组比较，1μmoL/L、5μmoL/L和10μmoL/L组细胞的Bcl-2和PARP蛋白表达显著降低，差异有统计学意义(FBcl-2=52.413,FPARP=65.669,P<0.05)；与1μmoL/L组比较，5μmoL/L和10μmoL/L组细胞的Bcl-2和PARP蛋白表达显著降低，差异有统计学意义(FBcl-2=31.693,FPARP=33.028,P<0.05)；与5μmoL/L组比较，10μmoL/L组细胞的Bcl-2和PARP蛋白表达降低，差异有统计学意义(tBcl-2=4.118,tPARP=3.576,P<0.05)。见图3。

图3 不同浓度巴马汀对细胞凋亡相关蛋白表达的影响

2.4巴马汀联合顺铂对细胞增殖活性的影响:与对照组比较，巴马汀组和顺铂组细胞的增殖活力均显著降低，差异有统计学意义(F=142.783,P<0.05)；与顺铂组比较，顺铂+巴马汀组细胞的增殖活力进一步降低，差异有统计学意义(t=4.684,P<0.05)。见图4。

图4 巴马汀联合顺铂对细胞增殖活性的影响

2.5巴马汀和顺铂对细胞凋亡的影响:与对照组比较，巴马汀组和顺铂组细胞的凋亡率均显著升高，差异有统计学意义(F=128.199,P<0.05)；与顺铂组比较，顺铂+巴马汀细胞的凋亡率均显著升高，差异有统计学意义(t=5.536,P<0.05)。见图5。

图5 巴马汀和顺铂对细胞凋亡的影响

2.6巴马汀和顺铂对细胞凋亡相关蛋白表达的影响:与对照组比较，巴马汀组和顺铂组细胞的Bcl-2和PARP蛋白表达均显著降低，差异有统计学意义(FBcl-2=59.186,FPARP=68.783,P<0.05)；与顺铂组比较，顺铂+巴马汀组细胞Bcl-2和PARP蛋白表达进一步降低差异有统计学意义(tBcl-2=3.514,tPARP=4.348,P<0.05)。见图6。

图6 巴马汀和顺铂对细胞凋亡相关蛋白表达的影响

3 讨 论

NSCLC的发生、发展受多种因素调控，多种原癌基因参与NSCLC细胞的增殖、分化和存活。KRAS基因定位于人12号染色体短臂，编码21kD的鸟苷酸结合蛋白，又称为p21基因。正常情况下，KRAS蛋白处于失活状态，而当KRAS基因突变后，KRAS蛋白质的结构发生改变并一直处于激活状态，从而持续刺激细胞生长，导致肿瘤的发生[3]。BRAF基因定位于人7号染色体长臂，通过编码具有丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶活性的Raf蛋白发挥生物学作用。研究表明，BRAF突变可增强BRAF蛋白激酶活性，促进细胞异常增殖和分化，从而导致肿瘤的发生[6]。亦有研究指出，BRAF/KRAS突变与NSCLC患者预后不良相关[7]。因此，寻找针对靶向BRAF/KRAS突变的药物对于治疗和改善NSCLC患者预后具有重要的临床意义。

近年来，研究发现，巴马汀可选择性抑制肿瘤细胞增殖、促进肿瘤细胞的凋亡，而不影响正常组织[5]。研究表明，巴马汀对卵巢癌细胞具有相对选择性，可诱导细胞凋亡，并增强卵巢癌细胞对顺铂的敏感性[5]。Liu等也证实，巴马汀可下调抗凋亡蛋白Bcl-2表达，诱导结肠癌细胞凋亡[8]。本研究采用不同浓度的巴马汀处理BRAF/KRAS突变A549细胞，结果发现巴马汀可明显抑制A549细胞的增殖活力，促进其凋亡，提示巴马汀具有抗肿瘤效应。

目前，顺铂被用作一线晚期NSCLC患者的标准化疗方案。然而，BRAF/KRAS突变可降低NSCLC细胞对以顺铂为主的化疗产生耐药性[9]。既往研究表明，巴马汀可诱导卵巢癌细胞的凋亡，并增强卵巢癌细胞对顺铂的敏感性[5]。本研究评估了巴马汀对顺铂抗肿瘤作用的影响。结果表明，巴马汀和顺铂处理均能降低NSCLC细胞的增殖活力，促进细胞凋亡。此外，巴马汀和顺铂联合应用可进一步降低NSCLC细胞的增殖活力，诱导细胞凋亡，提示巴马汀可增强NSCLC细胞的化疗敏感性。

研究表明，顺铂诱导NSCLC细胞凋亡的过程依赖于正常的细胞凋亡途径，若细胞抗凋亡机制增强或凋亡通路缺陷，则容易出现耐药[10]。Bcl-2基因是目前研究的最深入、最广泛的凋亡抑制基因之一，过表达的Bcl-2可增强细胞对DNA损伤因子的抵抗性，抑制顺铂引起的靶细胞凋亡。PARP是一种DNA损伤修复酶，也是细胞凋亡核心成员半胱天冬酶的切割底物，在DNA损伤修复与细胞凋亡中发挥着重要作用[11]。本研究结果显示，巴马汀处理BRAF/KRAS突变A549细胞后，Bcl-2和PARP表达均明显下调，细胞凋亡率明显升高。此外，巴马汀和顺铂联合应用可进一步降低Bcl-2和PARP表达，诱导细胞凋亡，提示巴马汀通过靶向凋亡抑制基因，增强NSCLC细胞的化疗敏感性。

综上所述，本研究结果显示，巴马汀可抑制BRAF/KRAS突变NSCLC细胞增殖，诱导细胞凋亡，并增强顺铂的抗肿瘤活性。因此，巴马汀可能是治疗BRAF/KRAS突变NSCLC的潜在药物。