对比mbk-2基因不同增强子对秀丽隐杆线虫胚胎发育的影响

张俊娣， 翟佳佳， 左志洪

(1.河北省廊坊市人民医院， 河北 廊 坊 065000 2.河北医科大学第二医院， 河北 石家庄 050000)

RNA 干扰(RNA interference，RNAi)通过导入细胞或组织内的双链 RNA(double-strand RNA，dsRNA)引起特异性的同源 mRNA 的降解或抑制翻译，导致相应蛋白功能受损。1998年，研究者首次在秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegan，C.elegans)揭示了 RNAi 现象，众多研究团队借助 RNAi 展开相关研究。C.elegans 基因组中与人类同源的基因高达 60%-80%，是第一个完成全基因组测序的动物[1]。目前已建立了包含87% C.elegans 已知基因的 RNA 干扰菌库，并且线虫的 RNAi 技术发展成熟且操作简单，可以对靶基因实施定向沉默[2]，这使得我们通过 RNAi 来进行遗传筛选具有可行性。C.elegans[3]是一种食细菌的线性动物，因其尺寸小、身体透明易观察、生活史时间短和易于培养等优势，成为了生物学实验重要的体内模式生物[4]。C.elegans从虫卵发育到成虫仅需3～4d，平均寿命大约为2～3周，是研究胚胎发育的良好载体。小头激酶2(minibrain kinase 2，mbk-2)可以通过调节微管蛋白从而影响早期胚胎发育[5]，是早期胚胎发育的重要调节蛋白。通过对mbk-2 RNAi筛选，发现了4种mbk-2的增强子(pptr-1、pptr-2、rsa-1和rsa-2)。由于RNAi可以有效的避免因某些基因功能缺失所引起的发育初期卵和幼虫的死亡，因此RNAi技术是研究胚胎发育初期相关基因的的有力手段。在本研究中，课题组借助RNAi技术深入的研究了mbk-2其及增强子在胚胎早期发育过程中的作用，以期为相关研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1秀丽隐杆线虫株系:野生型N2、mbk-2突变型线虫株系和OP50(大肠艾希杆菌)自美国秀丽线虫遗传中心(Caenorhabditis Genetics Center)购买。

1.2仪器及试剂:羧苄青霉素(美国SigmaA6140)；氨苄青霉素(上海BBI，A610028)；L4440质粒(美国Addgene)；氯化钠、蛋白栋和琼脂(北京索莱宝)。体式解剖显微镜(厦门Motic)；低温高速离心机(德国eppendorf)；激光共聚焦成像系统(德国Leica)。

1.3实验方法

1.3.1线虫生长培养基：称取1.5g NaCl、10g琼脂、1.3g蛋白胨，加入487mL ddH2O溶解上述试剂，高压玻璃纸封口，放入高压锅中灭菌。灭菌完成后，待培养基冷却后加入0.5mL Cacl2(1moL/L)、0.5mL胆固醇(5mg/mL)、0.5mL MgSO4(1moL/L)和12.5mL KPO4(1moL/L)缓冲液，倒入无菌培养皿中。NGM平板培养基室温放置2d后，滴加OP50菌，室温放置后用于培养线虫培养。

1.3.2线虫同步化培养：将生化培养箱温度设定为20℃，线虫放在NGM培养板上进行常规培养。用2mL Bleach裂解液冲洗NGM培养板，转移秀丽线虫到1.5mL EP管中，涡旋震荡，低速离心，弃上清。加入S-basal溶液，震荡混匀，低速离心，弃上清，重复至少两次以上操作。然后，加入S-buffer溶液重悬，放入生化培养箱25℃，恒温过夜培养。次日，离心后弃上清，剩余部分混匀，均匀涂在NGM培养基，进行培养。观察线虫至起进入产卵期，将该阶段的线虫挑到NGM培养基培养产卵。培养2～3h后将线虫(母虫)挑走，将NGM平板放入生化培养箱进行培养。次日，观察存活情况，待发育至L4期(成虫)后进行后续相关实验。

1.3.3RNAi干扰试验:将含目的基因(pptr-1、pptr-2、rsa-1和rsa-2)的RNAi菌株，涂布在LB固体培养基(含抗生素)上，37℃培养15h左右。将LB固体培养基上的RNAi菌落挑至LB液体培养基(含50g/L氨苄青霉素、12.5g/L四环素和1mmoL/L IPTG)中于37℃震荡过夜。次日，将含不同mbk-2增强子的菌液滴加在NGM琼脂平板上(含100g/L氨苄青霉素、12.5g/L四环素和1mmoL/L IPTG)，室温诱导过夜。将上一步中同步化好的N2及mbk-2基因突变线虫各分为6组，每组3个亚组，每亚组50只线虫。在NGM培养基中培养至L4期，喂食含目的基因(pptr-1、pptr-2、rsa-1和rsa-2)RNAi菌株，N2野生型及mbk-2基因突变线虫喂食含L4440空载质粒的RNAi菌株。

1.3.4孵化率测定:取300μL含RNAi菌株的培养基加至培养基平板，进行线虫培养。观察线虫发育至L4期，选取一定数量的线虫转移至含有30μL RNAi菌株的新的琼脂培养基上，孵育24h。将新的成虫转移到含特定增强子RNAi菌株的新平板上，培养24h后移除成虫。将平板上的子代放于生化培养箱培养并对产卵数进行统计，未孵化率=虫卵数/产卵数。

1.3.5线虫胚胎观察:线虫从L1阶段喂食含有特定增强子的RNAi菌株，直到线虫产卵前2d。将事先准备好的0.4mm琼脂垫和盖玻片以及M9缓冲液放入生化培养箱37℃孵育2h。使用移液枪小心滴加2μL的M9缓冲液至盖玻片，之后解剖10只左右处于产卵期的成虫，使用凡士林进行封片，DIC观察记录。通过DIC观察，记录虫卵补充的分裂阶段以及相关细胞器的变化。

2 结 果

2.1mbk-2增强子对N2野生型线虫虫卵孵化的影响:与N2+L4440组相比，mbk-2+L4440(RNAi)组虫卵未孵化率显著升高(P<0.05)。将含有mbk-2增强子(pptr-1、pptr-2、rsa-1和rsa-2)的RNAi细菌喂养线虫，观察抑制mbk-2增强子对N2野生型线虫虫卵孵化率的影响。结果显示，喂养pptr-1 RNAi细菌的N2野生型线虫虫卵未孵化率与N2 野生型线虫虫卵未孵化率相同，无统计学差异；喂养pptr-2、rsa-1和rsa-2 RNAi 细菌N2野生型线虫虫卵未孵化率显著高于N2+L4440 组(P<0.05)。见表1。

表1 N2野生型线虫RNAi虫卵未孵化率

2.2沉默mbk-2增强子对mbk-2突变型线虫虫卵孵化的影响:我们采用pptr-1、pptr-2、rsa-1和rsa-2的RNAi细菌喂养mbk-2突变型线虫，观察抑制pptr-1、pptr-2、rsa-1和rsa-2对mbk-2突变型线虫的影响。结果显示，沉默mbk-2突变型线虫mbk-2增强子后，四个沉默组虫卵未孵化率相较于mbk-2突变型线虫显著升高，有统计学意义(P<0.05)。与mbk-2+pptr-1(RNAi)组相比，其余增强子沉默组虫卵未孵化率显著升高，有统计学意义(P<0.05)。结果显示pptr基因中pptr-2增强子未孵化率显著高于pptr-1增强子(P<0.05)。同时rsa基因中rsa-2增强子未孵化率显著高于rsa-1增强子(P<0.05)。见表2。

表2 mbk-2突变线虫RNAi虫卵孵化率统计

2.3rsa-2和pptr-2基因沉默对mbk-2突变型线虫胚胎发育表型的影响:为了进一步研究mbk-2及其pptr和rsa增强子基因在胚胎发育过程中的调控作用，我们分别选取了pptr基因中未孵化率较高的增强子pptr-2和rsa基因中未孵化率较高的增强子rsa-2增强子基因进行进一步研究。rsa-2和pptr-2 RNAi细菌喂养mbk-2突变型线虫，并通过DIC对胚胎发育进行观察。结果显示，在胚胎发育单细胞阶段，mbk-2+rsa-2(RNAi)组相较于其余组在原核迁移方面(原核相遇没有接近细胞后部和原核没有移至胚胎中央)存在明显差异(P<0.05)。在胚胎发育的四细胞阶段，mbk-2+pptr-2(RNAi)组在细胞大小差异、多细胞核和细胞间接触异常等方面与其余组有明显差异(P<0.05)。见表3。

表3 线虫胚胎发育表型检测

3 讨 论

线虫的生命周期包括胚胎发育期、生产发育期、生殖期和生殖后期四个阶段[6]。Sulston第一次描述了C.elegans从受精卵到成虫的细胞谱系图，这也是多细胞生物唯一的一张细胞谱系图，这为其他研究者进行胚胎发育、细胞凋亡和性别决定等的相关研究奠定了基础[7]。基于线虫胚胎发育周期短以及发育图谱明确的前提下，利用RNAi技术特异性的沉默与胚胎发育相关的靶基因，可以特异性的研究该基因在胚胎发育过程中发挥的调控作用。因此，本研究利用RNAi技术特异性的沉默线虫mbk-2及其增强子的表达，深入探讨其在胚胎早期发育的调控作用。

mbk-2在胚胎发育阶段可以发挥调控纺锤体方向、原核迁移和微管稳定性等作用，对于胚胎的早期发育至关重要。结果显示，抑制mbk-2增强子可以显著提高虫卵未孵化率，进一步证明了mbk-2及其增强子在胚胎发育早期阶段发挥重要的作用。然而，实验结果显示抑制pptr-1的表达，虫卵未孵化率(0)与N2野生型没有统计学差异。我们猜测，可能是线虫体内有其它蛋白可以起到同等的替代作用或者是其增强作用不显著，在后续研究中我们将对其进行深入研究。表1中结果显示，除pptr-1外，其余三个增强子均可导致野生型线虫虫卵未孵化率升高，这表明其余三个增强子存在mbk-2基因以外调节胚胎发育的途径。

本研究结果显示mbk-2基因的调控作用对其增强子有较强的依赖作用。然而如表2中显示，在mbk-2突变型线虫中增强子pptr-1喂食组虫卵未孵化率为3.78±0.14%，而野生组为0。以上结果表明，mbk-2基因可能是pptr-1调控胚胎发育所必需的。文献指出，rsa-1、pptr-1和pptr-2是蛋白磷酸化酶2A(protein phosphatase 2A，PP2A)的亚单位，而PP2A是细胞有丝分裂的调节酶，与细胞进入有丝分裂周期、染色体向中板集合以及纺锤体集中的管卡密切相关[8]。rsa-1和rsa-2形成的复合物(RSA复合物)在有丝分裂纺锤体的形成中起作用，同时RSA复合物可以被募集至中心体中[9]，从而发挥调节有丝分裂的作用。我们猜测，mbk-2增强子可能也通过以上途径发挥调节早期胚胎发育的功能。选取pptr基因中未孵化率较高的增强子pptr-2和rsa基因中未孵化率较高的基因rsa-2进行影像分析。于是我们采用DIC观察pptr-2和rsa-2组在胚胎早期不同阶段的作用。以上结果揭示，pptr-2和rsa-2通过与mbk-2相互作用在胚胎发育阶段均可发挥调节作用，然而其调节的阶段可能不同，后续我们也将进一步研究mbk-2及其不同增强子在有丝分裂过程中的具体调节作用。