柚皮苷调节PERK/eIF2α/ATF4/CHOP轴对甲状腺癌细胞增殖凋亡迁移侵袭的影响

韦 丽， 张建军， 吴 锋， 刘宋芳， 杨世峰

(1.陕西省宝鸡市人民医院内分泌糖尿病科， 陕西 宝鸡 721000 2.陕西省西安市第九医院内分泌科， 陕西 西安 710000 3.西安交通大学第一附属医院肾内科， 陕西 西安 710000)

甲状腺癌是常见的内分泌系统恶性肿瘤，女性约占发病人数的75%，近年来，该病发病率逐年增加，死亡率趋于稳定。中国为甲状腺癌高发地区，每年甲状腺癌新增及死亡病例约占全球15%，严重威胁我国居民生命安全[1]。现代药理学表明，中药有效成分可抑制甲状腺癌的疾病进展，且治疗途径广泛、对患者副作用小[2]。柚皮苷是天然类黄酮化合物，能够保护心血管、抗氧化应激、抗炎和抗动脉粥样硬化，且其在食管癌小鼠中具有良好的抗肿瘤活性。研究显示，柚皮苷可促进化疗敏感性，柚皮苷联合紫杉醇治疗能够增强对前列腺癌细胞的毒性，抑制癌细胞增殖、转移，提示柚皮苷单独或联合紫杉醇可用于治疗前列腺癌[3]。内质网中营养、钙、氧及能力状态被破坏称内质网应激，内质网应激可激活未折叠蛋白反应(unfolded protein response，UPR)，促进肿瘤生长[4]，蛋白激酶R样内质网激酶/真核生物起始因子2α/活化转录因子4/CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白(protein kinase R-like ER kinase/Eukaryotic translation initiation factor alpha 2/activating transcription factor 4/CCAAT/enhancer-binding protein homologous protein，PERK-eIF2α-ATF4-CHOP)轴在内质网应激中起重要作用，可通过上调CHOP、Bcl-2和其他细胞凋亡相关因子诱导细胞凋亡[5]。本研究于2019年12月至2021年8月利用柚皮苷处理甲状腺癌B-CPAP细胞，探讨其通过PERK/eIF2α/ATF4/CHOP轴对B-CPAP细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭的影响。

1 材料与方法

1.1主要材料及仪器：人甲状腺癌细胞株B-CPAP由中国医学科学院提供，柚皮苷(批号：110722-201815，纯度≥98%，规格：20mg)购自中国Beyotime公司，胎牛血清(货号：12664025)购自美国Gibco BRL公司，ECL化学发光试剂盒(货号：abs920)购自爱必信(上海)生物科技有限公司，MTT试剂(货号：M8180)购自北京索莱宝科技有限公司，Annexin-V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒(货号：A9210)购自德国默克公司，p-PERK单克隆抗体(货号：AP328)、p-eIF2α单克隆抗体(货号：AF5803)购自上海碧云天生物技术有限公司，PERK单克隆抗体(货号：ab229912)、eIF2α单克隆抗体(货号：ab169528)、ATF4单克隆抗体(货号：ab184909)、CHOP单克隆抗体(货号：ab11419)、Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2 related X protein，Bax)单克隆抗体(货号ab32503)、B细胞淋巴瘤-2(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)单克隆抗体(货号ab32124)、细胞波形蛋白(Vimentin)单克隆抗体(货号ab92547)、E-钙黏蛋白(E-cadherin)单克隆抗体(货号ab231303)、N-钙黏蛋白(N-cadherin)单克隆抗体(货号ab76011)、GAPDH单克隆抗体(货号：ab8245)均购自艾博抗(上海)贸易有限公司。酶标仪(型号：Multiskan FC)购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司，流式细胞仪(型号：CytoFLEX)购自美国贝克曼库尔特有限公司，恒温培养箱(型号：BPH-9042)购自苏州贝锐仪器科技有限公司。

1.2方 法

1.2.1细胞培养与分组：取出冻存的B-CPAP细胞，融化后置于RPMI-1640培养基(含10%胎牛血清)中培养，37℃、5% CO2条件下孵育。于B-CPAP细胞生长至对数生长期时，加入不同浓度的柚皮苷(1、5、10、20μmoL/L)处理，并以不加柚皮苷的B-CPAP细胞为对照组，另采用PERK抑制剂GSK2606414(5μmoL/L)+20μmoL/L柚皮苷处理B-CPAP细胞作为抑制剂组。

1.2.2MTT检测细胞增殖：将B-CPAP细胞接种至96孔板(20000个/孔)中，收集不同浓度(1、5、10、20μmoL/L)柚皮苷处理48h的B-CPAP细胞，及20μmoL/L柚皮苷处理12、24、48h的B-CPAP细胞，PBS冲洗后，向每孔加入MTT 100μL，37℃孵育，并向每孔加入二甲基砜150μL，低速震荡10min，采用酶标仪检测各组B-CPAP细胞570nm处吸光值。B-CPAP细胞增殖率=柚皮苷处理组细胞吸光值/对照组细胞吸光值。

1.2.3流式细胞术检测细胞凋亡：采用Annexin V-FITC/PI流式细胞术检测各浓度B-CPAP细胞凋亡率。B-CPAP细胞经不同浓度柚皮苷处理48h后，经PBS洗涤，加入500μL结合缓冲液重悬，并加入FITC标记的Annexin V 5μL和PI 5μL，孵育30min(室温、避光)，采用流式细胞仪检测各组B-CPAP细胞凋亡率。

1.2.4细胞划痕实验：在6孔板中培养各组B-CPAP细胞，细胞密度为1×106个/孔，在无血清培养液中培养24h(37℃、5% CO2)，使用100μL枪头垂直划出两条直线，测定此时划痕面积(0h时划痕面积)，药物作用48h后拍照，倒置显微镜观察各组B-CPAP细胞迁移情况，并测量48h划痕面积。划痕愈合率(%)=(0h划痕面积-48h后划痕面积)/0h划痕面积×100%。

1.2.5Transwell实验：B-CPAP细胞经不同浓度柚皮苷处理48h后，使用Transwell试剂盒观察各组B-CPAP细胞侵袭能力。采用胰酶消化细胞，PBS清洗1-2次，无BSA培养基重悬细胞，调整细胞密度至1×105个/mL，向Transwell小室(Matrigel基质胶预先包被)上下室分别加入150μL细胞悬液、含BSA培养基，培养24h，乙醇固定5min，结晶紫染色，倒置显微镜观察各组穿膜细胞数。

1.2.6Western blot法检测蛋白表达：收集不同浓度柚皮苷处理48h后的B-CPAP细胞，使用RIPA裂解液充分裂解，收集细胞总蛋白，BCA试剂盒检测蛋白浓度。取50mg蛋白在12%的SDS-PAGE中分离，将其转移至PVDF膜，5%脱脂奶粉室温下封闭2h，加入稀释(1∶1000)后的对应一抗4℃孵育过夜，加入稀释(1∶2000)后的二抗孵育2h，ECL试剂盒显影，Image J软件分析。

2 结 果

2.1柚皮苷对B-CPAP细胞增殖的影响：与对照组相比，经1、5、10、20μmoL/L柚皮苷处理48h后，B-CPAP细胞增殖率依次下降，呈浓度依赖性(P<0.05)，20μmoL/L柚皮苷的下降效果最明显；与20μmoL/L相比，抑制剂组B-CPAP细胞增殖率升高(P<0.05)；20μmoL/L柚皮苷处理12h、24h、48h，B-CPAP细胞增殖率依次下降，呈时间依赖性(P<0.05)。见表1、表2。

表1 不同浓度柚皮苷处理48h后B-CPAP细胞增殖情况

表2 20μmoL/L柚皮苷处理不同时间后B-CPAP细胞增殖情况

2.2柚皮苷对B-CPAP细胞凋亡的影响：1、5、10、20μmoL/L柚皮苷处理的B-CPAP细胞凋亡率均高于对照组(P<0.05)，随柚皮苷浓度的递增，B-CPAP细胞凋亡率增加，呈浓度依赖性(P<0.05)；抑制剂组B-CPAP细胞凋亡率低于20μmoL/L组(P<0.05)。见图1、表3。

表3 不同浓度柚皮苷处理48h后B-CPAP细胞凋亡情况

图1 柚皮苷对B-CPAP细胞凋亡的影响

2.3柚皮苷对B-CPAP细胞迁移的影响：B-CPAP细胞划痕愈合率随柚皮苷浓度的递增而减少，呈浓度依赖性(P<0.05)；抑制剂组B-CPAP细胞划痕愈合率高于20μmoL/L组(P<0.05)。见图2、表4。

图2 柚皮苷对B-CPAP细胞迁移的影响(×200)

表4 不同浓度柚皮苷处理48h后B-CPAP细胞迁移情况

2.4柚皮苷对B-CPAP细胞侵袭的影响：B-CPAP穿膜细胞数随柚皮苷浓度的递增而减少，呈浓度依赖性(P<0.05)；抑制剂组B-CPAP穿膜细胞数高于20μmoL/L组(P<0.05)。见图3、表5。

表5 不同浓度柚皮苷处理48h后B-CPAP细胞侵袭情况

图3 柚皮苷对B-CPAP细胞侵袭的影响(结晶紫染色×400)

2.5柚皮苷对B-CPAP细胞Vimentin、E-cadherin、N-cadherin、Bax、Bcl-2蛋白表达的影响：随着柚皮苷浓度增加，B-CPAP细胞E-cadherin、Bax蛋白水平逐渐升高，Vimentin、N-cadherin、Bcl-2蛋白水平逐渐降低，呈浓度依赖性(P<0.05)；抑制剂组B-CPAP细胞E-cadherin、Bax蛋白水平均低于20μmoL/L组，Vimentin、N-cadherin、Bcl-2蛋白水平均高于20μmoL/L组(P<0.05)。见图4、表6。

表6 不同浓度柚皮苷处理48h后B-CPAP细胞Vimentin E-cadherin N-cadherin Bax Bcl-2蛋白水平变化

图4 柚皮苷对B-CPAP细胞Vimentin、E-cadherin、N-cadherin、Bax、Bcl-2蛋白表达的影响

2.6柚皮苷对B-CPAP细胞PERK/eIF2α/ATF4/CHOP轴的影响：随着柚皮苷浓度增加，B-CPAP细胞p-PERK/PERK、p-eIF2α/eIF2α、ATF4、CHOP蛋白水平逐渐升高，呈浓度依赖性(P<0.05)；抑制剂组B-CPAP细胞p-PERK/PERK、p-eIF2α/eIF2α、ATF4、CHOP蛋白水平均低于20μmoL/L组(P<0.05)。见图5、表7。

表7 不同浓度柚皮苷处理48h后B-CPAP细胞p-PERK/PERK p-eIF2α/eIF2α ATF4 CHOP蛋白水平变化

图5 柚皮苷对B-CPAP细胞PERK/eIF2α/ATF4/CHOP轴的影响

3 讨 论

近年来，全球范围内甲状腺癌的发病率有所增加，甲状腺癌主要包括三种组织学类型：分化型(乳头状和滤泡状)、未分化型(间变性)和甲状腺髓样癌，其中分化型甲状腺癌约占90%以上[6]。大多数甲状腺乳头状癌患者长期预后良好，但复发率(约25-35%)较高，因此临床需对复发性病变和转移进行积极治疗[7]。

天然植物提取物具有良好的抗肿瘤特性，且不良反应少。柚皮苷是从西柚、葡萄柚等果肉、果皮中提取的天然黄酮类物质，能够抑制多种肿瘤细胞增殖，诱导肿瘤细胞凋亡、坏死，并呈剂量依赖性[8]。研究显示，柚皮苷以剂量依赖性方式抑制结直肠癌细胞的增殖，促进Bax蛋白表达并下调Bcl-2蛋白水平，诱导结直肠癌细胞凋亡，还可抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路的激活，可能成为治疗结直肠癌的有效药物[9]。此外，Zhu等[10]研究发现，柚皮苷在体外可以显著抑制人卵巢癌细胞株SKOV3的增殖和迁移，还可以浓度、时间依赖性的方式抑制顺铂耐药的人卵巢癌株SKOV3/CDDP的增殖，其逆转机制可能与NF-κB、E-cadherin通路有关。本研究亦显示，随柚皮苷浓度的递增，B-CPAP细胞增殖率依次下降，细胞凋亡率增加，B-CPAP细胞划痕愈合率、穿膜细胞数减少，E-cadherin、Bax蛋白水平逐渐升高，Vimentin、N-cadherin、Bcl-2蛋白水平逐渐降低，均呈浓度依赖性；20μmoL/L柚皮苷处理12h、24h、48h，B-CPAP细胞增殖率依次下降，呈时间依赖性，提示柚皮苷可抑制B-CPAP细胞增殖、促进其凋亡，并具有浓度和时间依赖性，且能够降低B-CPAP细胞的迁移、侵袭能力。

内质网是一种重要的细胞器，其功能受损可引起内质网应激反应。在内质网应激反应的早期阶段，为保护正常的细胞功能，主要的反应是阻止未折叠蛋白的合成或促进正确的蛋白折叠；当适应性反应不能克服应激时，细胞内的凋亡途径就会被激活。内质网通过激活UPR保护细胞免受损害，而UPR与细胞暴露于不利条件(例如辐射)的持续时间有关，时间不同可能会产生不同的结果，如细胞适应压力或凋亡[11]。适当的UPR旨在降低内质网容量和蛋白质合成，使细胞适应压力，然而，在适应性反应不足的情况下，内质网应激会诱导细胞凋亡并激活CHOP、JNK、Bcl-2的表达。内质网应激可激活内质网应激传感器PERK表达，从而诱导CHOP的转录，即上调PERK/ATF4/CHOP通路并促进细胞凋亡。激活的PERK会引发UPR相关的促凋亡信号，提高磷酸化eIF2α水平，通过ATF4激活适应性信号通路，抑制全局蛋白质合成和选择性翻译；而ATF4表达增加可提高CHOP表达水平，CHOP过表达可下调Bcl-2表达，上调Bax水平，并诱发细胞凋亡。此外，CHOP还可通过另一种促凋亡机制发挥作用，通过直接激活生长停滞和DNA损伤诱导蛋白GADD34，促进eIF2α的去磷酸化并重新启动受压力细胞的蛋白质翻译。研究发现，在异丙肾上腺素诱导的心肌损伤模型中，活性氧(ROS)过量从而触发内质网应激损伤，附子灵可通过PERK/eIF2α/ATF4/Chop通路抑制ROS触发的内质网应激，防止心肌细胞凋亡[12]。本研究结果显示，随着柚皮苷浓度增加，B-CPAP细胞p-PERK/PERK、p-eIF2α/eIF2α、ATF4、CHOP蛋白水平逐渐升高，呈浓度依赖性；添加PERK抑制剂可降低B-CPAP细胞p-PERK/PERK、p-eIF2α/eIF2α、ATF4、CHOP蛋白表达，抑制PERK/eIF2α/ATF4/CHOP途径，从而逆转柚皮苷对B-CPAP细胞的增殖、迁移、侵袭抑制及凋亡促进作用，与Albayrak等[13]研究相似，提示柚皮苷可能通过引发内质网应激，激活PERK/eIF2α/ATF4/CHOP凋亡途径，从而影响甲状腺癌B-CPAP细胞的增殖、凋亡、迁移及侵袭过程。

综上所述，柚皮苷能可能通过激活PERK/eIF2α/ATF4/CHOP轴抑制B-CPAP细胞增殖、促进其凋亡，降低B-CPAP细胞迁移、侵袭能力。