恩替诺特通过调控miR-103a-3p/PIEZO1通路抑制口腔鳞状细胞癌细胞增殖迁移侵袭的机制研究

李 鹏

(首都医科大学附属北京口腔医院， 北京 100050)

口腔鳞状细胞癌(OSCC)是一种侵袭、转移能力较强的恶性肿瘤[1]。该病在诊断、治疗方面取得了一定进展，但是由于晚期治疗预后差、复发率高的问题，患者的存活时间仍令人不满意。临床上仍缺乏有效的精准高效治疗药物。恩替诺特是一种基于氨基苯甲酰胺的组蛋白去乙酰化酶(HDAC)抑制剂[2,3]，其在乳腺癌中的抗增殖、促凋亡作用得到体内外研究的证实[4]。恩替诺特在OSCC中的抗癌功效得到初步发展[5]，但是其发挥作用的分子机制仍需继续探索。微小RNA(miRNA)是一种保守的内源单链18～25个核苷酸的非编码小分子，可影响靶基因的转录、翻译，调节蛋白表达，进而参与人类疾病的发展过程[6]。miR-103a-3p在多种癌症中失调，参与癌症的恶化或治疗进展，其中包括OSCC[7,8]。但是其是否与恩替诺特的抗OSCC有关仍未可知。机械敏感离子通道蛋白(Mechanosensitive ion channel protein，PIEZO1)能够通过多种机制发挥致癌作用[9]。本研究拟以OSCC细胞WSU-HN6为研究对象，观察恩替诺特、miR-103a-3p、PIEZO1对WSU-HN6细胞增殖、迁移侵袭的影响，揭示恩替诺特的抗癌作用与miR-103a-3p、PIEZO1之间的联系。

1 材料与方法

1.1材料:恩替诺特(批号：209783-80-2；纯度≥99%)来自南京恩德萨生物科技有限公司；口腔鳞状细胞癌细胞WSU-HN6(CVCL_5516)来自美国菌种保藏中心；胎牛血清来自杭州仟诺生物公司；DMEM培养液来自浙江GENOM；脂质体2000转染试剂来自美国Invitrogen；实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)试剂盒来自日本TAKARA；细胞计数试剂盒(CCK8)来自日本同仁；Transwell小室来自美国Corning；兔抗E-cadherin、N-cadherin、PIEZO1多抗、HRP标记的二抗均来自上海艾博抗；双荧光素酶报告基因检测试剂盒来自上海碧云天研究所。

1.2方 法

1.2.1细胞培养:WSU-HN6细胞使用10%胎牛血清+1%青链霉素的DMEM培养液，置于37℃、5%CO2的饱和湿度空气的恒温细胞培养箱中培养。隔天更换一次细胞培养液。

1.2.2细胞转染:细胞培养液将恩替诺特调至0.0、0.5、1.0、2.0、4.0μmoL/L，与WSU-HN6细胞分别共培养24、48、72h。筛选2.0μmoL/L处理48h的WSU-HN6细胞为最适细胞。3-5倍质量的脂质体试剂将antagomiRNA、antagomiR-103a-3p、pcDNA、pcDNA-PIEZO1、2.0μmoL/L+antagomiRNA、2.0μmoL/L+antagomiR-103a-3p、2.0μmoL/L+antagomiR-103a-3p+si-NC、2.0μmoL/L+antagomiR-103a-3p+si-PIEZO1转染WSU-HN6细胞，设为antagomiRNA组、antagomiR-103a-3p组、pcDNA组、pcDNA-PIEZO1组、2.0μmoL/L+antagomiRNA组、2.0μmoL/L+antagomiR-103a-3p组、2.0μmoL/L+antagomiR-103a-3p+si-NC组、2.0μmoL/L+antagomiR-103a-3p+si-PIEZO1组，转染8h后，更换新培养基继续培养至48h，用RT-qPCR或WB实验检测转染的效果。

1.2.3CCK8实验检测细胞增殖:收集各组培养48h的细胞，按照CCK8试剂盒要求处理细胞，调整细胞浓度。1000个细胞/孔接种96孔板，每孔10μL的CCK8反应液，微微震荡，混匀，避光孵育25min。490nm波长下检测细胞的吸光度(OD490)。细胞增殖率(%)=(OD490实验组-OD490对照组)/OD490对照组×100%。

1.2.4Transwell实验检测细胞迁移侵袭:收集各组培养48h的细胞，更换为无任何营养因子、血清的培养基，饥饿处理24h，待用。准备含有基质胶的小室和不含基质胶的小室，37℃预热。用基质胶模拟人体的细胞外基质，检测细胞破坏基质发生侵袭的能力。用不含基质胶的小室检测细胞的迁移能力。将细胞调至0.5×104个/mL，取200μL铺匀在上室，取600μL含有营养因子和血清的培养基置下室，37℃培养箱常规培养12h。小心取出小室，上室下膜朝上，浸入4%对聚甲醛固定，结晶紫染色。显微镜下计数，拍照。采用五点法计数，取平均值。

1.2.5WB实验检测细胞E-cadherin、N-cadherin、PIEZO1蛋白:收集各组培养48h的细胞，裂解液充分裂解，提取总蛋白并定量，变性。用变性后的上清做蛋白电泳上样模板，行SDS-PAGE电泳。结束后，用转膜仪将蛋白从胶转移至PVDF膜。2.5%脱脂奶粉封闭液37℃封闭2h。逐滴加入一抗(兔抗E-cadherin多抗，1∶1000；兔抗N-cadherin多抗，1∶1500；兔抗PIEZO1多抗，1∶1000)，约10mL，4℃孵育过夜。PBS洗膜，再滴加二抗(HRP标记的二抗，1∶500)，浸没膜，37℃孵育1.5h。ECL发光液显影，曝光。用Image J分析蛋白条带的灰度值，目的灰度值/内参灰度值表示蛋白相对表达量。

1.2.6RT-qPCR实验检测细胞miR-103a-3p、PIEZO1:收集各组培养48h的细胞，用RNA提取试剂盒、反转录试剂盒提取总RNA并合成cDNA，-20℃保存。打开RT-qPCR试剂盒，严格按照说明书要求操作，检测样本中miR-103a-3p、PIEZO1的表达情况。U6、GAPDH为内参，2-△△Ct法计算。所用引物：miR-103a-3p，正向引物5′-GCGAGCAGCATTGTACAGG-3′，反向引物5′-GTGCAGGGTCCGAGGTATTC-3′；PIEZO1正向引物5′-GGACTCTCGCTGGTCTACCT-3′，反向引物5′-GGGCACAATATGCAG GCAGA-3′；U6正向引物5′-GCTTCGGCAGCACATATACT-3′，反向引物5′-GTGCAGGGT CCGAGGTATTC-3′;GAPDH正向引物5′-GACCTGACCTGCCGTCTAG-3′，反向引物5′-AG GAGTGGGTG TCGCTGT-3′。

1.2.7双荧光素酶报告基因实验检测miR-103a-3p与PIEZO1的结合力:靶基因在线预测网站Starbase(https://starbase.sysu.edu.cn/)、targetscan(https://www.targetscan.org/)预测miR-103a-3p的靶基因，发现PIEZO1为其下游靶点之一。根据互补的结合位点序列合成PIEZO1 3′UTR-WT片段(含有互补的结合位点的野生序列)和PIEZO1 3′UTR-MUT片段(不含有互补的结合位点的突变序列)，并插入荧光载体，构建银光报告基因。将构建的荧光基因与agomiRNA、agomiR-103a-3p、antagomiRNA、antagomiR-103a-3p共转染至WSU-HN6。恢复室温的双荧光素酶报告基因检测试剂盒，按照操作手册要求操作，检测细胞的荧光活性。用细胞的相对荧光活性强度表示miR-103a-3p与PIEZO1的结合能力的强弱。

2 结 果

2.1恩替诺特对口腔鳞状细胞癌细胞增殖的影响:结果如图1所示，24、48、72h的2.0、4.0μmoL/L恩替诺特处理WSU-HN6细胞的增殖率显著低于1.0μmoL/L恩替诺特处理的WSU-HN6细胞，多因素重复测量方差分析呈时间浓度依赖性(F总=19.45，F时间=180.100，F处理=69.530，P<0.05)。2.0μmoL/L浓度处理的WSU-HN6细胞的增殖率的降低幅度最大，故选用该浓度用于后续研究。

图1 不同浓度恩替诺特处理的WSU-HN6细胞的增殖率

2.2恩替诺特对口腔鳞状细胞癌细胞迁移侵袭的影响:结果如图2和表1所示，与0.0μmoL/L组相比，2.0μmoL/L组细胞迁移、侵袭数量均显著降低，E-cadherin蛋白表达显著升高，N-cadherin蛋白表达显著降低(P<0.05)。

表1 恩替诺特处理的WSU-HN6的细胞迁移侵袭及相关蛋白表达

图2 E-cadherin、N-cadherin的蛋白表达

2.3恩替诺特调控口腔鳞状细胞癌细胞miR-103a-3p、PIEZO1表达:结果如图3和表2所示，与0.0μmoL/L组相比，2.0μmoL/L组细胞miR-103a-3p表达显著升高，PIEZO1的mRNA和蛋白表达均显著降低(P<0.05)。

表2 恩替诺特处理的WSU-HN6细胞miR-103a-3p PIEZO1的表达

图3 IEZO1蛋白表达

2.4抑制miR-103a-3p调控口腔鳞状细胞癌细胞增殖、迁移侵袭:结果如图4和表3所示，与antagomiRNA组相比，antagomiR-103a-3p组细胞miR-103a-3p表达显著降低，细胞增殖率、迁移数量、侵袭数量均显著升高，E-cadherin蛋白表达显著降低，N-cadherin蛋白表达显著升高(P<0.05)。

图4 E-cadherin、N-cadherin蛋白表达

表3 抑制miR-103a-3p的WSU-HN6细胞增殖迁移侵袭情况

2.5过表达PIEZO1调控口腔鳞状细胞癌细胞增殖、迁移侵袭:结果如图5和表4所示，与pcDNA组相比，pcDNA-PIEZO1组细胞PIEZO1的mRNA和蛋白表达均显著升高，细胞增殖率、迁移数量、侵袭数量均显著升高，E-cadherin蛋白表达显著降低，N-cadherin蛋白表达显著升高(P<0.05)。

表4 过表达PIEZO1的WSU-HN6细胞增殖迁移侵袭情况

图5 PIEZO1、E-cadherin、N-cadherin的蛋白表达

2.6miR-103a-3p靶向PIEZO1:Starbase(https://starbase.sysu.edu.cn/)、targetscan(https://www.targetscan.org/)预测到miR-103a-3p与PIEZO1之间的互补结合位点，如图6A。双荧光素酶报告实验显示，miR-103a-3p可抑制野生型PIEZO1细胞的荧光活性，而对其它细胞的荧光活性无显著影响，如图6B。与agomiRNA组相比，agomiR-103a-3p组细胞PIEZO1的mRNA和蛋白表达均显著降低，与antagomiRNA组相比，antagomiR-103a-3p组细胞PIEZO1的mRNA和蛋白表达均显著升高，如图6C、D、E。

图6 miR-103a-3p靶向调控PIEZO1

2.7敲减PIEZO1逆转抑制miR-103a-3p、恩替诺特对口腔鳞状细胞癌细胞增殖、迁移侵袭的影响:结果如图7和表5所示，与2.0μmoL/L+antagomiRNA组相比，2.0μmoL/L+antagomiR-103a-3p组细胞miR-103a-3p表达显著降低，细胞增殖率、迁移数量、侵袭数量均显著升高，E-cadherin蛋白表达显著降低，N-cadherin蛋白表达显著升高(P<0.05)；与2.0μmoL/L+antagomiR-103a-3p+si-NC组相比，2.0μmoL/L+antagomiR-103a-3p+si-PIEZO1组细胞miR-103a-3p表达显著升高，细胞增殖率、迁移数量、侵袭数量均显著降低，E-cadherin蛋白表达显著升高，N-cadherin蛋白表达显著降低(P<0.05)。

表5 抑制PIEZO1和miR-103a-3p的WSU-HN6细胞增殖迁移侵袭情况

图7 E-cadherin、N-cadherin的蛋白表达

3 讨 论

恩替诺特能够逆转食管鳞癌的顺铂耐药、调节口腔鳞癌细胞的增殖和细胞周期的功能[10]，但是其在口腔鳞状细胞癌细胞的表型调控中的作用仍为十分清楚。Marques及其团队[11]的最新研究报道，恩替诺特可抑制口腔鳞癌细胞增殖，细胞周期阻滞G0/G1期，诱导癌细胞凋亡，活性氧大量增加，组蛋白H3和组蛋白H4乙酰化增加，揭示恩替诺特的抗癌价值。本研究发现，恩替诺特能够以浓度依赖性抑制口腔鳞状细胞癌细胞增殖，并抑制癌细胞的迁移和侵袭，促进E-cadherin表达，抑制N-cadherin表达，本实验结果再次确定了恩替诺特对口腔鳞状细胞癌细胞表型的恶化抑制作用。令人遗憾的是，恩替诺特在口腔鳞状细胞癌中发挥抗癌作用的机制尚未十分清楚。进一步研究发现，恩替诺特明显的上调癌细胞中miR-103a-3p的水平，且抑制PIEZO1的表达，也许miR-103a-3p、PIEZO1与恩替诺特的抗癌作用存在一定的联系。

有研究报道，miR-103a-3p在口腔鳞状细胞癌患者中高表达，且与患者的不良预后紧密相关，抑制miR-103a-3p后，口腔鳞状细胞癌细胞增殖得到控制，凋亡能力得到增强，并且还抑制异种移植裸鼠肿瘤的生长[12]。Liu等[13]在舌鳞状细胞癌研究中发现，miR-103a-2-5p与LncRNA LTSCCAT直接存在直接靶向关系，参与上调的LTSCCAT的促进癌细胞迁移侵袭作用，这暗示miR-103a-2-5p参与舌鳞状细胞癌细胞的迁移侵袭作用。本研究发现，miR-103a-3p在口腔鳞状细胞癌细胞中被恩替诺特的上调，并且抑制miR-103a-3p能够明显的增强了癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力，并且还明显的削弱了恩替诺特对癌细胞的增殖迁移侵袭抑制作用。这些实验结果证实了miR-103a-3p在口腔鳞状细胞癌中发挥抑癌基因的功能，这与Liu[13]在舌鳞癌中的研究结果相吻合，支持miR-103a-3p的抑癌功能。与Zhang[12]在口腔鳞癌中的研究结果相悖，认为miR-103a-3p可能不具有致癌的潜力。miRNA在癌症中的调控网络十分复杂，相关的上下游作用机制相互交叉，同一个miRNA在癌症的不同通路中的功能是不同的。本研究在体外细胞中验证了miR-103a-3p的抑癌作用，后续将在至少3株癌细胞及裸鼠体内为此结果提供更有说服力的理论支持。深入研究还发现，miR-103a-3p可靶向负调控PIEZO1的表达，于是推测PIEZO1可能与miR-103a-3p在口腔鳞状细胞癌中的功能有关。

PIEZO1是一种保守的多功能蛋白，在恶性肿瘤中作为致癌基因发挥着重要作用，在人类癌症的诊断、预后中具有巨大潜在价值。Hasegawa等[14]发现，PIEZO1以YES相关蛋白(YAP)信号通路的靶点，有利于口腔鳞状细胞癌细胞的增殖，上调在癌组织中的表达。本研究发现，PIEZO1的表达水平能够被恩替诺特抑制，并且过表达PIEZO1促进了口腔鳞状细胞癌细胞的增殖、迁移和侵袭，抑制E-cadherin，促进N-cadherin，这验证了PIEZO1在口腔鳞状细胞癌中的致癌作用，与Hasegawa的实验结果相一致。这个实验结果暗示，PIEZO1作为miR-103a-3p下游靶标之一，确实可能参与miR-103a-3p的抗癌作用。进一步研究发现，敲减PIEZO1能够增强恩替诺特的药效，减弱下调miR-103a-3p对癌细胞增殖、迁移侵袭的促进作用。

综上所述，恩替诺特抑制口腔鳞状细胞癌细胞增殖、迁移和侵袭，产生这种作用的机制与miR-103a-3p/PIEZO1通路有关，为恩替诺特用于口腔鳞状细胞癌的治疗提供实验支持。