黄芩苷对复发性口腔溃疡模型大鼠IL-33/ST2信号通路的影响及机制研究

魏雅楠， 刘晓慧， 马远新

(河北省沧州中西医结合医院， 河北 沧州 061000)

复发性口腔溃疡(Recurrent oral ulcer，ROU)是常见的口腔疾病，其发病率高，多见于女性[1]。临床上，该病的主要症状是唇、舌、软腭等黏膜部位反复出现溃疡，表现为圆形或者椭圆形，通常伴有局部的红肿和灼痛[2]。目前，该病的诱因以及发病机制还不完全清楚。ROU的临床治疗通常是采用西药进行消炎、止痛并促进溃疡部位愈合，但效果并不显著，而传统的中草药对ROU有较好的治疗作用[3]。黄芩苷主要取自黄芩的干燥根部，是一种黄酮类生物活性物质，具有抗炎、杀菌、镇痛之疗效[4]。既往研究[5]表明甘草泻心汤对ROU的治疗效果明显，且复发率低。黄芩苷是甘草泻心汤的主要成分之一，因此本研究推测单独黄芩苷治疗可能对ROU有同样的作用。相关文献[6]显示黄芩苷通过抑制白细胞介素-33/肿瘤发生抑制蛋白2(Interleukin-33/suppression of tumorigenicity 2，IL-33/ST2)信号通路影响炎症因子表达，进而改善过敏性鼻炎。但黄芩苷能否通过调控该通路影响ROU进展未见报道。因此，本研究通过黄芩苷干预观察其对ROU模型大鼠的疗效及其与IL-33/ST2信号通路的关系。

1 材料与方法

1.1实验动物:8周龄健康雄性清洁级Sprague Dawley大鼠，体重200～220g，均购于北京实验动物研究中心有限公司，SYXK(京)2021-0045为其动物许可证号。所有大鼠自由进食、喝水，均饲养在恒温恒湿、12h光照、12h黑暗的环境下。

1.2药物、试剂与仪器:弗氏完全佐剂(CFA)购自江苏科惟生物技术有限公司；黄芩苷(纯度≥98%)购自成都仪睿生物科技有限公司；左旋咪唑(纯度≥99%)购自上海源叶生物科技有限公司；T淋巴细胞亚群检测试剂盒购自北京同生时代生物技术有限公司；干扰素-γ(Interferon-γ，IFN-γ)、白细胞介素(interleukin，IL)-17、IL-2、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)酶联免疫吸附试剂盒购自江苏生物科技有限公司；还原型谷胱甘肽(glutathione，GSH)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)测试盒购自南京建成生物研究所；IL-33、ST2、核因子kB(Nuclear factor-kB，NF-kB)单克隆抗体及辣根过氧化物酶标记的二抗购自美国Abcam公司。组织匀浆机购自上海净信实业发展有限公司；酶标仪购自美国伯乐公司；垂直电泳仪购自常州德杜精密仪器有限公司；流式细胞仪购自美国BD公司。

1.3实验分组、造模及给药方法:按照随机数字表法将60只大鼠分成正常组，模型组，低、中、高剂量黄芩苷组和左旋咪唑组，每组10只。除正常组外，其余各组大鼠均按照Xie L等[7]的方法进行ROU造模：大鼠麻醉后在口腔黏膜下注入生理盐水，剥离黏膜并制备成组织匀浆，将其与CFA按照1∶1比例混合均匀。造模前1d将各组大鼠的两侧脊柱进行脱毛，造模时将0.2mL的抗原乳化液皮下注射至脊柱左右区域，每周一次，持续8周，正常组仅注射CFA。模型构建成功后，低、中、高剂量黄芩苷组大鼠分别灌胃25、50、100mg/kg黄芩苷，左旋咪唑组大鼠灌胃17.5mg/kg左旋咪唑[8]，正常组和模型组大鼠每天灌胃等量的生理盐水，每天1次，持续20d。

1.4大鼠溃疡症状的观察和记录:给药结束后，肉眼观察并记录各组大鼠口腔溃疡症状，包括溃疡数目、持续时间、间隔时间。

1.5大鼠外周血T淋巴细胞亚群含量的测定:取100μL EDTA抗凝处理后的大鼠外周血，将其放入流式管底部，分别加入20μL APC-CD3、PE-CD4、FITC-CD8抗体，混合均匀，20min后在加入2mL溶血素，继续混匀，静置10min，离心、弃去上清液，并用PBS对细胞进行重悬，最后使用流式细胞仪检测CD4+、CD8+水平，并计算CD4+/CD8+比值。

1.6大鼠血清细胞因子水平的测定:各组大鼠给药结束后，将其麻醉，经腹主动脉取血10mL，放在不含抗凝剂的试管中，静置30min后，离心，取上清液，一部分依据酶联免疫吸附试剂盒方法检测IFN-γ、IL-17、IL-2、TNF-α水平。

1.7大鼠血清氧化应激标志物含量的测定:取1.6中剩余血清，检测其GSH、SOD、MDA含量，具体操作方法严格根据对应试剂盒说明书进行。

1.8大鼠口腔黏膜组织中IL-33/ST2信号通路相关因子蛋白水平的检测:将各组大鼠安乐死后，取其口腔黏膜组织，将其研磨成匀浆，提取总蛋白，定量后上SDS-PAGE凝胶电泳仪分离蛋白，并将其转至PVDF膜上，封闭后加入IL-33、ST2、NF-kB一抗，次日加入二抗，孵育结束后进行显影，并以β-actin为内参，分析不同蛋白表达水平。

2 结 果

2.1黄芩苷对ROU大鼠溃疡状况的影响:与正常组相比，模型组大鼠溃疡数目增多，持续时间显著增加，间隔时间显著延长(P<0.05)；与模型组相比，低、中、高剂量黄芩苷组大鼠溃疡数目和持续时间明显减少，间隔时间明显延长(P<0.05)，表现为剂量依赖性，而左旋咪唑组与高剂量黄芩苷组间大鼠溃疡数目、持续时间和间隔时间无明显变化(P>0.05)，见表1。

表1 黄芩苷对ROU大鼠溃疡状况的影响

2.2黄芩苷对ROU大鼠外周血T淋巴细胞亚群含量的影响:与正常组比较，模型组CD4+含量及CD4+/CD8+降低，CD8+含量升高(P<0.05)，且差异均有统计学意义；与模型组比较，低、中、高剂量黄芩苷组CD4+含量及CD4+/CD8+显著增加，CD8+含量显著减少(P<0.05)，而低剂量黄芩苷组CD8+变化较小，没有显著差异(P>0.05)；与高剂量黄芩苷组相比，左旋咪唑组上述指标均无明显改变(P>0.05)，见表2。

表2 黄芩苷对ROU大鼠外周血T淋巴细胞亚群含量的影响

2.3黄芩苷对ROU大鼠血清细胞因子的影响:模型组大鼠血清中IFN-γ、IL-17、IL-2、TNF-α含量明显多于正常组(P<0.05)；低、中、高剂量黄芩苷组大鼠血清中IFN-γ、IL-17、IL-2、TNF-α含量依次低于模型组(P<0.05)，而左旋咪唑组IFN-γ、IL-17、IL-2、TNF-α含量与高剂量黄芩苷组的差异不具有统计学意义(P>0.05)，见表3。

表3 黄芩苷对ROU大鼠血清细胞因子的影响

2.4黄芩苷对ROU大鼠血清氧化应激水平的影响:与正常组相比，模型组GSH、SOD含量明显下降，MDA含量明显上升(P<0.05)；与模型组相比，低、中、高剂量黄芩苷组GSH、SOD含量显著增加，MDA含量显著减少(P<0.05)，呈剂量依赖性；而与高剂量黄芩苷组相比，左旋咪唑组GSH、SOD升高不显著、MDA下降不显著(P>0.05)，见表4。

表4 黄芩苷对ROU大鼠血清氧化应激水平的影响

2.5黄芩苷对ROU大鼠口腔黏膜组织中IL-33/ST2信号通路相关蛋白表达的影响:与正常组相比，模型组大鼠口腔黏膜组织中IL-33、ST2、NF-kB蛋白表达显著上调(P<0.05)；与模型组相比，低、中、高剂量黄芩苷组大鼠口腔黏膜组织中IL-33、ST2、NF-kB蛋白表达显著下调(P<0.05)，且低剂量黄芩苷组>中剂量黄芩苷组>高剂量黄芩苷组；而左旋咪唑组与高剂量黄芩苷组IL-33、ST2、NF-kB蛋白表达没有明显差异(P>0.05)。见图1、表5。

表5 黄芩苷对ROU大鼠口腔黏膜组织中IL-33/ST2信号通路相关蛋白表达的影响

图1 各组大鼠口腔黏膜组织中IL-33、ST2、NF-kB蛋白表达水平

3 讨 论

食物、心情、激素、口腔的局部创伤及菌群失调均能诱发ROU。该病一旦发作就疼痛难忍，且容易反复，不仅影响饮食，还妨碍语言、情绪，对人们的生活、工作产生非常不利的影响。中医学将ROU归类到“口疮”范畴，认为ROU的病症虽在口腔中，但其发生发展与人们的五脏六腑联系密切。近年来发现，中草药在ROU的治疗方面有着不可替代的作用[3]。黄芩苷是从中药黄芩根中提取的生物活性物质，其功能多样，例如抗癌[9]、抗炎[4]等。以往研究[5]发现甘草泻心汤可减轻ROU患者口腔炎症反应，有助于其黏膜的修复，在预防病情反复发生效果显著。黄芩苷作为甘草泻心汤的主要成分之一，可能对ROU有类似的治疗效果。因此，本研究通过建立ROU大鼠模型，观察黄芩苷对ROU的治疗效果并探讨其作用机制。

相关研究[7]表明ROU的发生与自身免疫失调有关，CD4+和CD8+是T淋巴细胞的两个亚群，二者作用相反，互相制衡和调节，是检测机体免疫反应水平的重要指标，CD4+/CD8+比值的降低可使口腔黏膜发生局部溃疡。本研究结果显示，模型组大鼠溃疡数目和持续时间明显增加，间隔时间明显延长，CD4+含量及CD4+/CD8+降低，CD8+含量升高，与曲宸等[10]和Xie L等[7]的研究结果一致，说明ROU大鼠模型构建成功，也进一步揭示ROU的发生与细胞免疫有关。经黄芩苷治疗后，ROU大鼠的溃疡病症明显改善，CD4+含量及CD4+/CD8+显著增加，揭示黄芩苷通过调节T淋巴细胞亚群失衡对ROU大鼠有明显的治疗作用。

血清中IFN-γ、IL-17、IL-2、TNF-α等细胞因子的异常表达是导致ROU发生的主要因素之一，IFN-γ是Th1细胞分泌的细胞因子，其水平与溃疡病情的严重程度呈正比[11]。IL-17是一种促炎因子，由活化的T细胞分泌而来，能够刺激上皮细胞炎症因子的释放，进而导致机体炎症的发生[12]。TNF-α的增多会诱导IL-2等炎症因子的产生，致使炎性细胞浸润增加，从而加重溃疡程度[13]。本研究发现，黄芩苷可下调炎症因子水平，说明黄芩苷可通过调节T淋巴细胞亚群失衡影响炎症因子的水平，进而改善ROU大鼠的炎症反应。

炎症反应的加剧导致大量自由基产生，进而使机体发生氧化应激损伤。而抗氧化能力的下降也是ROU发生的原因之一，GSH、SOD和MDA是检测机体氧化应激水平的标志物。有文献[14]显示，在口腔溃疡发生时，GSH、SOD含量升高，MDA含量下降。本研究结果显示，黄芩苷可通过提高GSH、SOD含量、降低MDA含量降低ROU大鼠的氧化损伤，进而对ROU起治疗作用。

上述研究均表明黄芩苷通过降低炎症反应和氧化损伤对ROU产生治疗作用，但是其具体机制还不清楚。IL-33通过与ST2和辅助受体IL-1受体辅助蛋白(IL-1RAcP)组成的异二聚体受体结合，进而在靶细胞上发挥作用。有文献[15]显示茯苓多糖通过抑制IL-33、ST2蛋白表达减轻溃疡性结肠炎的浸润程度。也有研究[6]表明在过敏性鼻炎模型大鼠中，IL-33、ST2、NF-kB mRNA表达显著上调。与上述研究一致，ROU大鼠口腔黏膜组织IL-33、ST2、NF-kB蛋白表达显著提高，而黄芩苷处理后上述蛋白水平均明显下调，表明黄芩苷可能通过抑制IL-33/ST2通路调节炎症因子及氧化应激标志物水平改善炎症和氧化损伤，进而对ROU模型大鼠发挥治疗作用。

综上所述，黄芩苷对ROU模型大鼠具有明显的治疗作用，其机制可能是抑制IL-33/ST2通路的激活，降低炎症反应、氧化损伤以及调控T淋巴细胞亚群，进而加快口腔黏膜的修复，为ROU的临床治疗提供新的靶向药物，但是其远期疗效还需进一步研究。