阿拉尔市部分即食食品中单增李斯特氏菌分离鉴定和药敏试验

郑雅雯，韩 慧，米热依·奴尔沙热普，巴合达吾列提·达吾列提汗，吴 静

(塔里木大学动物科学学院，新疆阿拉尔 843300)

单核细胞增生李斯特氏菌(Listeriamonocytogenes，LM)简称单增李斯特氏菌，是革兰氏阳性短杆菌，可引起人兽共患病。单增李斯特氏菌对生存环境要求较低，可在低温、高渗透压环境存活，能够在食品加工、运输、冷藏等多个环节中繁殖。误食被单增李斯特氏菌污染的食品后可引起败血症和脑膜炎，孕妇可引起流产[1-2]。世界卫生组织(WHO) 将其列为仅次于大肠埃希氏菌、沙门氏菌和志贺氏菌的第四大重要食源性致病菌。近年来，由单增李斯特氏菌引发的食物中毒时有报道[3]，单增李斯特氏菌感染病死率较高[4-5]。低温冷藏即食食品是单增李斯特氏菌主要传染来源[6]。为了解阿拉尔市即食食品中单增李斯特氏菌的污染情况，2020年-2021年用随机抽样法采集阿拉尔市超市、农贸市场及餐饮店等场所未食用的熟肉制品、生食蔬菜、沙拉和甜点等即食食品360份，用GB/T4789.30-2016定性检测方法进行单增李斯特氏菌的分离培养、鉴定及小鼠致病性试验，用圆纸片扩散法(K-B法)对分离菌株进行药敏试验，为本市即食食品单增李斯特氏菌风险评估及防治提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要试剂 单增李斯特氏菌增菌肉汤(LB1:每225 mL LB中加入 丫啶黄素3 mg/支 ，萘啶酮酸5 mg/支，LB2：每200 mL LB中加入 丫啶黄素5 mg/支，萘啶酮酸4 mg/支)， 杭州微生物试剂有限公司产品；PALCAM琼脂，杭州微生物试剂有限公司产品；单增李斯特氏菌生化鉴定管，青岛日水生物技术有限公司产品；胰酪胨大豆酵母浸膏琼脂，杭州微生物试剂有限公司产品；药敏纸片，北京天坛药物生物技术开发公司产品；革兰氏染液由塔里木大学兽医微生物实验室提供。

1.1.2 主要仪器 实时微生物生长分析系统，杰灵仪器制造有限公司生产；数显不锈钢电热培养箱，上海博迅实业有限公司生产；洁净工作台，上海博迅实业有限公司生产；光学显微镜，Olympus公司生产。

1.2 方法

1.2.1 样品的采集 2020年5月至2021年2月从超市、农贸市场和餐饮店分别采集即食食品各120份，共计360份,按样品种类分熟肉制品、生食蔬菜(水萝卜、黄瓜、西红柿)和甜点各90份。采集时间为2020年5月、8月、11月和2021年2月，共开展4次，每次90份，每个采样地点30份。样品采集按照无菌操作要求采集，每份样品重量不少于250 g，置于无菌袋，4 h内送至实验室检测。熟肉制品、生食蔬菜(水萝卜、黄瓜、西红柿)和甜点心采用深层采样法，检样为25 g，沙拉样品搅拌均匀后，取25 g作为检样。

1.2.2 样品中单增李斯特氏菌的分离与鉴定 按照文献[7]定性检测方法进行单增李斯特氏菌的分离培养与鉴定。以无菌操作取样品25 g(mL)加入到含有225 mL LB1增菌液中,于30℃±1℃培养24 h±2 h,移取0.1 mL,转种于10 mL LB2增菌液内,于30℃±1℃培养24 h±2 h。取LB2二次增菌液划线接种于李斯特氏菌显色平板和PALCAM琼脂平板,于36℃±1℃培养24 h～48 h,观察各个平板上生长的菌落。把可疑菌落进行染色镜检并移植得到纯培养，对纯培养进行生化鉴定。

1.2.3 小鼠致病性试验 用实时微生物生长分析系统进行单增李斯特氏菌生长曲线测定及浓度测定，制备1.0×1010CFU/mL对数期的菌悬液进行毒力检测。取此菌悬液进行小鼠腹腔注射，每株菌注射2只，每只注射0.5 mL，观察小鼠发病及死亡情况，并设置对照组，对照组小鼠注射0.5 mL灭菌生理盐水。

1.2.4 单增李斯特氏菌药敏试验 用圆纸片扩散法(K-B法)测定单增李斯特氏菌对抗菌药物的敏感性。

2 结果

2.1 不同类型食品中单增李斯特氏菌的带菌情况

360份样品中共分离出23株单增李斯特氏菌，总污染率为6.39%。每种食品均受到不同程度污染，其中熟肉制品污染情况最严重，为8.89%，生食蔬菜检出率为7.78%，沙拉和甜点心检出率相同，为4.44%(表1)。

表1不同类别即食食品中单增李斯特氏菌带菌情况

2.2 不同采集地点单增李斯特氏菌的污染情况

在餐饮店中检出李斯特菌数量最多为10株，阳性率最高为8.33%；农贸市场检出8株，阳性率6.67%；超市检出5株，阳性率为4.17%，检出率仅为餐饮店的一半(表2)。

2.3 不同采集时间单增李斯特氏菌的污染情况

2020年-2021年4个月进行样品采集，对食品中单增李斯特氏菌检出率进行统计(表3)。4个月中8月检出率最高，为10.00%，5月检出率次之，为6.67%)；11月和2月检出率分别为5.56%和3.33%，各季度单增李斯特氏菌检出率有明显差别(表3)。

表2不同采集地点即食食品中单增李斯特氏菌污染情况

表3不同采集时间即食食品中单增李斯特氏菌污染情况

2.4 单增李斯特氏菌致病性

对小鼠腹腔注射菌悬液5×109CFU/只，每组2只共24组，其中1组是对照试验。结果感染组小鼠1 d～3 d表现精神沉郁、行动缓慢、食欲低下，死亡7只,在3 d～6 d集中死亡了27只，总死亡率为83.3%,对照组均正常。

2.5 单增李斯特氏菌的耐药性

对分离的23株单增李斯特氏菌进行11种抗菌药物的药敏试验，结果显示食品中分离株总的耐药率为21.7%；主要对氯霉素、四环素、复方新诺明有耐药作用，耐药率分别为8.7%、8.7%、4.3%；对诺氟沙星、庆大霉素和氯霉素各有1株不敏感，对其他抗生素没有耐药性(表4)。

3 讨论

采集360份食品样本，检测出单增李斯特氏菌阳性样品23份，总检出率为6.39%。不同食品种类检出率差异较大，其中熟肉制品检出率最高，为8.89%；其次为生食蔬菜，检出率为7.78%；沙拉和甜点心检出率较低，均为4.44%。不恰当的冷藏也会引起李斯特菌污染，生食蔬菜检出率也较高，为减少单增李斯特氏菌污染，熟肉尽量不要放冰箱太久，同时要注意冰箱定期消毒，刀具等规范使用，在食用动物性食品时尽量彻底加热，生食的蔬菜也要清洗干净[8]。不同采样地点单增李斯特氏菌的污染状况各不相同，餐饮店李斯特菌检出率为8.33%，农贸市场和超市分别为6.67%和4.17%。餐饮店检出率为超市2倍。

表4即食食品中单增李斯特氏菌对11种抗菌药物耐药结果

本文对分离的23株单增李斯特氏菌进行药敏试验，结果显示食品中的李斯特菌对四环素、氯霉素和复方新诺明有耐药作用，对诺氟沙星、庆大霉素和氯霉素均有1株不敏感，其余药物均为敏感，耐药率最高的是四环素和氯霉素为8.7%，不同地区单增李斯特氏菌的耐药情况不同。通过本次调查研究初步掌握了单增李斯特氏菌在阿拉尔市居民消费品中的污染状况、分布特点、耐药状况、可能引起食源性李斯特菌病的重点食物种类及食品污染较高的场所，对本地区预防控制单增李斯特氏菌所引起的食源性疾病和指导食源性李斯特菌病的治疗和控制具有重要参考价值。