围产期奶牛子宫的免疫调节研究进展

曹 旭，马 馨，吕文发

(1.吉林农业大学动物科学技术学院 动物医学院，吉林长春 130118；2.吉林农业大学现代农业技术教育部国际合作联合实验室，吉林长春 130118；3.吉林农业大学动物生产与产品质量安全教育部重点实验室，吉林长春 130118)

炎症是影响子宫能否顺利复归的重要因素。分娩后子宫内膜脱落，子宫复归和上皮再生大约需要4周[1]。在此期间，奶牛子宫内膜非常容易受到外界病原菌的侵害，同时机体会重新分配营养物质以支持泌乳期间营养需求。因此，产后发生先天免疫受损和新陈代谢紊乱的风险显著增加，大约50%产后奶牛在围产期经历一种或多种生殖道炎疾病，包括胎衣不下、亚临床子宫内膜炎、子宫内膜炎、宫颈炎和阴道炎[2]。

奶牛围产期中性粒细胞的趋化性、吞噬作用以及氧化爆发功能降低，被认为是导致子宫感染几率增加的主要原因之一。这种中性粒细胞功能降低的机制可能包括营养缺乏、能量负平衡及相关的组织动员而导致的血液代谢物浓度紊乱。本文综述了影响生殖道先天免疫的因素，并探讨了围产期奶牛免疫功能调节的有效治疗方法，以期为围产期奶牛生殖道疾病的预防及饲养管理提供理论依据。

1 产后子宫的复归

分娩后，牛产道和子宫会出现天然损伤。牛的胎盘属于结缔绒膜胎盘，在胎盘形成时，胚胎绒毛膜上成簇的绒毛插入母体子宫肉阜内形成的陷窝中，子宫内膜上皮细胞被侵蚀，绒毛直接与母体的结缔组织接触。因此，当胎盘脱落后，子宫内膜对子宫肉阜保护丧失，加之分娩后机体免疫力下降，细菌的负荷和致病性、感染或病理性炎症占上风，导致子宫炎症的发生[3]。

中性粒细胞是产犊后在子宫内出现的最丰富的炎症细胞类型。子宫中性粒细胞增加是子宫上皮细胞和常驻巨噬细胞的免疫受体被激活引起炎症级联反应的结果，导致以分泌炎性细胞因子和趋化因子(TNF-α、IL-1、IL-6)为特征的促炎状态。这种炎症级联反应被激活后，子宫腔中的中性粒细胞比例在产后第1周达到40%以上，到产后第4周降至5%以下[4]。目前，尚不清楚过度或持续的炎症是否是由不同类型或数量细菌感染、或免疫功能及代谢调节的不稳定引起，或者由两者共同作用引起[5]。患有非子宫疾病的奶牛与患有胎盘残留或子宫炎的奶牛在随后产犊的比例上有类似程度降低，患有非子宫疾病的奶牛在第5天或第6天的高质量胚胎百分比降低，以及从第45天到足月的更大妊娠损失。

2 能量负平衡和全身炎症

产犊前3周至产犊后3周先天免疫功能降低和炎症调节功能紊乱是生殖道炎性疾病发生的重要原因。虽然所有围产期奶牛在产后早期都经历了不同程度的能量负平衡和全身炎症，但机体对能量负平衡的适应及全身炎症的加重可能是引发生殖道炎性疾病的重要原因。产后早期酮体或非酯化脂肪酸(NEFA)浓度升高与亚临床型子宫内膜炎的发生呈正相关，同时，奶牛围产期中性粒细胞功能降低与NEFA、触珠蛋白浓度、酮体浓度呈负相关，与细胞内糖原储存呈正相关[6]。

葡萄糖是免疫功能的重要原料[7]。在奶牛体内，葡萄糖被大量重新分配到乳腺以合成用于产乳的乳糖，奶牛产犊前最后1周采食量平均会减少30%，在产犊后1周才恢复食量，在哺乳期营养需求量增加了1倍以上。能量负平衡以适应性及同源性反应为特征，其特征在于外周胰岛素抵抗和脂肪动员，以及随后将NEFA释放到血流中。非酯化脂肪酸通过激素敏感脂肪酶的作用从甘油三酯分子中分离出来，作为生产牛乳的能源[8]。在肝脏中，NEFA重新酯化为甘油三酯或通过β-氧化产生能量。然而，NEFA也可能促进炎症[9]、抑制中性粒细胞氧化暴发功能和造成胰岛素抵抗，肝细胞摄取NEFA也会产生酮体。酮类作为外周组织(尤其是肌肉)的能量底物，有研究将酮症与全身炎症指标联系起来。产犊后发生酮症的奶牛，其循环脂多糖(LPS)浓度升高，LPS浓度的升高可能刺激全身炎症，但目前无法确定LPS的来源。此外，酮症(血BHB>3 mmol/L)常伴随着血清中促炎细胞因子TNF-β、IL-1β和IL-18的浓度升高及抗炎性IL-10的浓度较低，暗示肝脏中NF-κB通路可能被激活[10]。

分娩与炎症加剧有关(如宫颈中IL-8的表达)。目前胎盘分离的机制尚不完全清楚，但是包括来自中性粒细胞和巨噬细胞的基质金属蛋白酶在产犊期间常造成子宫组织损伤。因此，在分娩、胎盘排出和子宫复归等正常生理活动中会存在一定程度的炎症。然而，人们越来越认识到炎症不仅是机体对损伤或疾病的反应，而且可能是代谢紊乱的后果[11]。促炎细胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α可以刺激肝脏产生急性期蛋白，包括触珠蛋白和血清淀粉样蛋白α。这些促炎物质可能来自脂肪动员或胃肠道，也有可能是产后子宫的炎症过程。脂肪活化产生TNF-α和IL-6，其能阻断胰岛素的细胞内信号传导，从而促成胰岛素抵抗，反过来又加剧了脂肪中NEFA的释放[12]。此外，NEFA通过结合Toll样受体-4(LPS的传感器，来自革兰氏阴性细菌的主要毒素，子宫炎的重要参与者)可以直接导致炎症进程的加剧。

3 先天免疫功能

分娩时，循环皮质醇浓度急剧增加，导致L-选择素表达下调。并通过抑制迁移来增加循环中的中性粒细胞数量，但分娩后中性粒细胞数量略有下降，可能是中性粒细胞迁移到炎症部位，如产后子宫和乳腺。这种先天免疫功能的改变增加了胎衣不下、子宫炎、PVD、亚临床子宫内膜炎和乳腺炎的风险。

分娩后白细胞会向子宫募集。中性粒细胞释放后，其主要功能包括活化内皮细胞黏附和迁移、病原体识别和中和。中性粒细胞的胞浆中有许多含有溶菌酶的颗粒，与病原体的相互作用刺激溶酶与吞噬体的融合，从而促进病原体杀灭和进一步的吞噬作用，功能性中性粒细胞合成细胞因子(如IL-8)以维持对急性炎症的正反馈并招募更多的中性粒细胞[13]。在清除感染源后，中性粒细胞会经历程序性细胞死亡(凋亡)。如果细胞凋亡失败，可能导致促炎症途径的持续激活引起慢性炎症，如亚临床子宫内膜炎。成功凋亡的最终结果是中性粒细胞分裂成与膜结合的小体，被新到达的中性粒细胞和巨噬细胞清除。此外，凋亡的中性粒细胞会进行反向迁移并返回骨髓以调节进一步的中性粒细胞反应。

目前，关于炎症是如何被下调并转变为愈合直至转变为基础状态的过程仍知之甚少。炎症所需的自我限制部分由专门的促分解介质介导，如由ω-3脂肪酸合成的分解素、脂氧素和保护素；这与来自花生四烯酸途径的促炎类花生酸(如前列腺素)相反。中性粒细胞在解决炎症和启动组织修复中的作用可能还未被充分认识。吞噬凋亡的中性粒细胞导致释放抗炎或恢复性细胞因子，如IL-10和TGF-β，而不是促炎细胞因子[14]。与巨噬细胞的经典型(M1)和活化型(M2)表型相似，中性粒细胞被描述为具有相似的N1和N2功能亚群。考虑到产后的子宫健康，分娩后需要迅速、有力和有效的中性粒细胞流入子宫，亚临床子宫内膜炎可能在一半的病例中是一种持续的、失调的“无菌”炎症。假设炎症的调节是亚临床子宫内膜炎发病机制的核心，通过营养和药物途径调节炎症的解决应该是未来奶牛研究的一个重要目标。

4 子宫免疫功能调节

4.1 非甾体抗炎药

一个健康并且具有良好调节作用的产后子宫炎症反应对于耐受或消除病原体、恢复卵巢功能和避免生殖疾病是必不可少的[15]。但是如果全身炎症状态过度或持续时间过长，可能会影响正常的子宫复归。炎症和免疫的异常调节是导致临床型或亚临床子宫内膜炎的决定因素。因此，使用非甾体抗炎药(NSAID)可减少产后早期的全身性炎症，并最终可能有助于减少生殖道疾病的发生。

高产奶牛产后代谢特征是促炎细胞因子(如TNF-α、IL-1、IL-6和IL-8)的基因表达或循环浓度升高。非甾体抗炎药的治疗作用是通过抑制环氧化酶(COX)，减少前列腺素的形成实现的。环氧合酶有2种亚型，即组成型环氧合酶-1(COX-1)和诱导型环氧合酶-2(COX-2)。非甾体抗炎药通过抑制COX-2抑制全身炎症，但是其副作用则是会抑制COX-1。非甾体抗炎药可以调节转录因子，如NF-κB，它可以调节包括TNF-α和IL-1β在内的促炎细胞因子的产生。

非甾体抗炎药通过抑制COX-2通路、肿瘤形成和肿瘤生长，减少了与胰岛素抵抗相关的全身炎症，降低了结肠癌和直肠癌的风险。研究还表明，服用大剂量非甾体抗炎药的2型糖尿病患者的空腹血糖、总胆固醇、甘油三酯和胰岛素清除率降低。奶牛产后第1周口服非甾体抗炎药会导致机体低葡萄糖和高NEFA的不利反应，但治疗奶牛在短期内具有更高的肝脏胰岛素敏感性，并且在整个哺乳期产奶量升高[16]，不过目前其代谢作用和对子宫健康的影响还未见报道。研究指出，用美洛昔康治疗奶牛全身炎症的第2天到最后1天血清触珠蛋白降低，并改善了能量代谢指标(治疗期间β-羟基丁酸酯较少，胰岛素样生长因子-1较高)[17]。产后14 d的多形核中性粒细胞(PMN)功能得到改善，但子宫内膜炎症状态没有受到影响。可以进一步研究抗炎治疗对全身炎症、能量代谢的作用机制，并优化非甾体抗炎药剂量、治疗时间和持续时间，以改善动物健康。

4.2 粒细胞巨噬细胞集落刺激因子

粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)可以刺激干细胞产生粒细胞(中性粒细胞，嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞)和单核细胞。单核细胞离开循环并迁移到组织中，随后它们成熟为巨噬细胞和树突细胞[18]。因而是免疫/炎症级联的一部分，通过该级联，少量巨噬细胞的活化可以迅速导致其数量的增加，这是对抗感染一个关键的过程。此外，在胚胎着床、胎盘发育时期以及在月经周期等子宫结构剧烈变化时期，GM-CSF对子宫内膜组织再生具有促进作用[19]。GM-CSF可以靶向建立或维持妊娠所需的白细胞。研究表明，免疫环境的破坏会损害胎盘的发育，其后果包括胎儿生长受限和不良的围产期结局，类似于在GM-CSF缺失突变小鼠中看到的结果[20]。

有研究使用子宫灌注乙醇的方式建立小鼠子薄型子宫内膜模型，使用不同浓度的GM-CSF处理其组织贴壁细胞，发现GM-CSF有利于小鼠受损子宫内膜再生，增加子宫内膜厚度，促进子宫内膜腺细胞中Ki67的表达，并改善植入位点的数量[21]。此外，GM-CSF可以促进原发性人类子宫内膜腺细胞的增殖和子宫内膜基质细胞的迁移。GM-CSF通过激活PI3K/AKT信号通路促进人子宫内膜腺细胞的增殖。也有研究表明，GM-CSF可以提高子宫内中性粒细胞丰度[22]。而产后奶牛正处于免疫力波动时期，因此在产后使用GM-CSF来提高中性粒细胞丰度，进而提高产犊后奶牛的子宫免疫功能，降低产后疾病是可行的。但是关于这一方向仍需进一步研究[23]。

4.3 牛重组白细胞介素-8

白细胞介素-8(IL-8)是一种有效的中性粒细胞趋化激活因子，主要由内皮细胞、上皮细胞和吞噬细胞产生，由于其调节先天免疫功能的潜力，体外试验证明重组牛白介素-8(rbIL-8)处理的中性粒细胞趋化特性是对照组的10倍[24]。在奶牛生殖道进行体内中性粒细胞趋化试验。子宫内注射1125 μg生理盐水稀释的rbIL-8，分别在给药后3 h和1 h显著增加阴道和子宫腔中中性粒细胞的比例。静脉注射或宫内注射1125 μg rbIL-8后，未观察到对健康的不良影响。在进一步的试验中[25]，同一研究组在104头初产奶牛和109头多产荷斯坦奶牛产后24 h内分别注入低或高剂量的rbIL-8(11.25 μg和1125 μg rbIL-8稀释于250 ml盐水中)。监测奶牛胎衣不下、产褥期子宫炎和PVD。rbIL-8治疗降低了多产奶牛产后子宫炎的发生率，但对胎盘残留或PVD的发生率没有影响。虽然有试验证明rbIL-8对产后奶牛的子宫健康有积极效果，但仍然需要更大的随机对照试验来评估分娩后使用rbIL-8对子宫炎、PVD和亚临床子宫内膜炎发病率的影响。但目前rbIL-8的作用机制尚不明确。

4.4 钙代谢的调节

围产期钙稳态被大量输出用于生产初乳，引起产后血钙浓度显著降低[26]。血钙严重降低可导致临床低钙血症，但亚临床低钙血症(血总钙<2.1 mmol/L)可影响50%以上的多产奶牛[27]，并与血液中性粒细胞计数减少、中性粒细胞功能受损和子宫炎发病率增加有关[27]。负的膳食阳离子-阴离子差(dietary cation-anion difference，DCAD)饮食在产前喂养会引起轻度代谢性酸中毒，导致产后钙代谢改变及血钙升高。两项Meta分析表明，降低DCAD日粮可降低胎盘残留、子宫炎和整体疾病的几率[28-29]。喂食DCAD的奶牛发病率降低可能与免疫功能改善有关。也有一项研究表明，产前饲喂阴性的DCAD可导致中性粒细胞β-防御素的表达增加，进而促进产后健康[30]。与喂食阳性DCAD(+130 mEq/kg)的奶牛相比，喂食阴性DCAD饲料(-130 mEq/kg)的经产奶牛中性粒细胞的吞噬功能和氧化爆发荧光强度仅轻度增加[31]。钙的细胞外流入对中性粒细胞的活化很重要，但钙在中性粒细胞功能中的作用还不完全清楚。产犊后给予肠外钙补充剂对中性粒细胞氧化爆发或吞噬功能没有改善[32]。在另一项试验中产犊前喂养阴性(-100 mEq/kg)或阳性(+100 mEq/kg)DCAD饲料的奶牛中未发现中性粒细胞吞噬或氧化爆发的差异。

关于钙对子宫疾病的影响也有研究表明，在诊断为子宫炎奶牛中可以观察到较低的血清钙浓度，同时注射脂多糖也可以诱发血钙浓度降低。也就是说，低钙血症与生殖道疾病有关，但其机制尚不清楚。因此，是否可以通过预防或早期治疗亚临床低钙血症的方法作为提高免疫功能和预防生殖道疾病的手段还需进一步研究。

5 展望

先天免疫功能下降是生殖道炎症性疾病高发的重要原因，在产犊前2周到产犊后3周，调节围产期奶牛的先天免疫应答，有助于减少生殖道炎症性疾病的发生。产后子宫炎症可能是由于子宫内膜对病原的耐受性失败所引起，一旦病原体克服子宫内膜耐受，迅速而强大的先天免疫反应对于对抗它们是必不可少的。而相比于现在大多数产后使用抗生素治疗的方法，增强奶牛先天免疫以及中性粒细胞功能可以降低产后奶牛发生子宫炎症几率，同时也在一定程度上规避由抗生素治疗带来的耐药性风险。未来随着对子宫免疫功能相关研究的推进，将会减少由子宫炎症产生的负面影响及经济损失，使养牛业健康发展。