钩藤对肉鸡源多重耐药大肠埃希氏菌临床分离株生物被膜的抑制作用

侯思梦，左景茹，吴 强，刘 俐，彭海飞，刘晓强*

(1.西北农林科技大学动物医学院，陕西杨凌 712100；2.陕西省富平县畜牧发展中心，陕西富平 711700)

大肠埃希氏菌(Escherichiacoli,E.coli)是临床上分离率最高的革兰氏阴性菌之一，属于人类和动物肠道内的正常菌群，也是一种条件性致病菌，一旦产生致病性，可导致肠道内或肠道外感染，甚至引起死亡[1-3]。由于畜牧生产和兽医临床实践中抗菌药物的不规范使用，导致细菌耐药性增加[4]。细菌生物被膜的形成是细菌耐药机制之一[5]。生物被膜是指细菌在物体表面黏附并增殖，并将自身嵌入在由其所分泌的物质形成的胞外聚合物所形成的一种高度水合的开放结构[6]。生物被膜具有独特的三维结构，其耐药性和环境适应性大大提升。生物被膜一旦形成，不仅难以去除，膜内的细菌在停药后仍可继续生长繁殖，增加了治疗难度[7]。钩藤是一种传统中药，具有降压、抗心律失常、镇静、抗血栓、抗癌等作用[8]。钩藤碱具有抗菌活性，对多种肠道致病菌有抑制作用[9]。但目前有关钩藤对动物源病原菌的抗菌作用及其生物被膜的作用鲜见报道，本研究以肉鸡源耐药性大肠埃希氏菌为研究对象，探讨钩藤对大肠埃希氏菌的抗菌效果及对其生物被膜的作用，为抗菌中药的筛选提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 12株受试大肠埃希氏菌(1～12)，2018年5月～9月分离自陕西渭南地区3个不同规模的肉鸡养殖场，经前期鉴别培养基、革兰氏染色镜检、细菌微量生化管分离鉴定及16S rRNA方法鉴定，且体外药敏试验证实12株受试菌均为对包含头孢噻呋在内的多种药物耐药的多重耐药菌株。大肠埃希氏菌ATCC 25922，由兽医药理学研究室保存。

1.1.2 主要药品及试剂 钩藤，西藏自治区拉萨市雪域大药房产品；酵母粉、胰蛋白胨，英国Oxoid公司产品；MH培养基，青岛高科园海博生物技术有限公司产品；琼脂粉，北京索来宝科技有限公司产品；结晶紫(分析纯)，广东光华科技股份有限公司产品；头孢噻呋，大连美仑生物技术有限公司产品。

1.1.3 主要仪器 液体加热器，广东潮安金石镇柏源五金制品厂产品；台式低速离心机，湖南赫西仪器装备有限公司产品；电子天平，上海天美天平仪器有限公司产品；多功能酶标仪，帝肯(上海)贸易有限公司产品；微生物培养箱，上海一恒科学仪器有限公司产品。

1.2 方法

1.2.1 药液的制备 采用水煎法制备。称取粉碎后的钩藤20 g，加入10倍量纯化水，室温浸泡过夜，煎煮1 h，用八层折叠的纱布过滤，收集滤液。再加入适量纯化水，按上述方法煎煮过滤。重复3次。将3次的滤液合并，加热浓缩至50 mL，分装入10 mL离心管，4 000 r/min离心5 min，取上清液加热浓缩至10 mL，得到浓度为1 g/mL的药液，4℃保存备用。头孢噻呋配制为1 280 μg/mL的溶液，置-20℃保存备用。

1.2.2 最小抑菌浓度和最小杀菌浓度测定 参照美国临床检验标准委员会(CLSI)推荐的微量稀释法测定最小抑菌浓度(MIC)，将MIC和高于MIC浓度的各个梯度的培养物0.1 mL，接种于MH琼脂培养板，37℃培养18 h后观察有无菌落形成，无菌落形成的相应孔中的最低药物浓度即为钩藤对大肠埃希氏菌的最小杀菌浓度(MBC)。以大肠埃希氏菌ATCC 25922作为质控菌株，每个样品重复3次。

1.2.3 钩藤和头孢噻呋联合用药时部分抑菌浓度的测定 取无菌96孔细胞培养板，采用棋盘法，在96孔细胞培养板的每孔中加入100 μL稀释好的106CFU/mL的大肠埃希氏菌菌悬液。根据2.2中MIC值的测定结果，分别取2×MIC浓度的钩藤和头孢噻呋溶液50 μL，在96孔细胞培养板的横列和纵列中倍比稀释6～8个稀释度，形成不同浓度组合的2种药物混合液。混匀后置于37℃培养箱，培养18 h后观察结果。部分抑菌浓度(Fractional inhibitory concentration,FIC)=联合用药时甲药的MIC/单独应用时甲药的MIC+联合用药时乙药的MIC/单独应用时乙药的MIC，FIC指数≤0.5时表示协同、>0.5～≤1表示相加、>1～≤2表示无关、>2时表示拮抗作用。

1.2.4 钩藤对大肠埃希氏菌生长曲线的影响 取若干支试管，每管加10 mL LB液体培养基，每组设1/4×MIC、1/2×MIC、MIC、2×MIC等4个钩藤浓度梯度组和未加药对照组(钩藤浓度为0)，再向每支试管加入对应菌液0.1 mL并混匀。立刻测定OD600nm值，之后每隔2 h 测定OD600nm值1次，以培养时间为横坐标，以OD值为纵坐标绘制大肠埃希氏菌生长曲线。

1.2.5 大肠埃希氏菌生物被膜形成能力的测定 大肠埃希氏菌生物被膜的培养和测定参照文献[10]。在无菌96孔细胞培养板中加入200 μL经1∶100稀释的菌液，每菌做6个复孔，以无菌LB培养液为空白对照，37℃培养48 h。培养结束后，弃去培养液并用灭菌生理盐水轻柔漂洗3次，洗去杂质和浮游菌。然后在每孔加入200 μL甲醇，固定15 min后弃去甲醇，晾干。加入200 μL 1%结晶紫溶液染色5 min，用生理盐水洗涤3次。洗去未结合的染液，晾干。每孔加入200 μL浓度为33%的冰醋酸，30 min后测定OD570nm值，试验重复3次。依据ODc值(ODc等于空白孔的平均OD值+3倍的标准差)对生物被膜分类：OD≤ODc，无成膜能力(-)；ODc

1.2.6 钩藤对大肠埃希氏菌生物被膜的影响 将钩藤用LB培养液稀释为500、250、125、62.5、31.3、15.6、7.8 mg/mL的含药溶液，分别取上述含药溶液100 μL于96孔细胞培养板中，再加入菌液100 μL，作为试验组，阳性对照孔只加入菌悬液，阴性对照孔只加入LB培养基，每个浓度的药液作6个复孔。将头孢噻呋用灭菌的纯化水稀释为512、256、128、64、32 、16、8 μg/mL的浓度，其余步骤与钩藤试验组处理方式相同。37℃培养48 h，再按1.2.5中的方法染色处理，用酶标仪测定OD570nm值，试验重复3次。

1.2.7 数据统计分析 用SPSS 21.0 软件对试验数据进行统计分析，大肠埃希氏菌生物被膜定量分析结果均用“平均值±标准差”表示。显著性检验采用ANOVA分析，P<0.05时判定差异显著。

2 结果

2.1 钩藤对大肠埃希氏菌MIC和MBC的测定

12株临床分离菌株对头孢噻呋均具有耐药性，其MIC≥8 μg/mL。钩藤对所有受试菌的MIC范围7.8 mg/mL～125 mg/mL，MBC范围15.6 mg/mL～250 mg/mL(表1)。

2.2 钩藤和头孢噻呋联合用药时FIC的测定

头孢噻呋与钩藤联用时对受试菌的FIC值介于0.5～2，其中对4(30.8%)株受试菌的FIC≤0.5，呈现协同作用，8(61.5%)株受试菌的0.5

2.3 钩藤对大肠埃希氏菌生长曲线的影响

加入不同浓度钩藤的受试菌，从生长曲线可看出药物处理组对数期和稳定期OD600nm值均小于未加药对照组(钩藤浓度为0)，且浓度越高，OD600nm值越小。受试菌的对数生长期起始时间随着药物浓度增大而有所推迟(图1)。

2.4 大肠埃希氏菌产生物被膜能力的测定

12株大肠埃希氏菌分离株均能生成生物被膜，其中中等产膜能力的4株(33.3%)，产膜能力较强的菌株有8株(66.7%)(表2)。

表1钩藤和头孢噻呋对大肠埃希氏菌的MIC、MBC和FIC值

图1不同浓度钩藤下耐药性大肠埃希氏菌的生长曲线

2.5 钩藤对大肠埃希氏菌生物被膜形成的影响

不同浓度的钩藤对9株(69.2%，9/13)大肠埃希氏菌生物被膜的形成具有不同程度的抑制作用，对其余菌株生物被膜的抑制作用不明显(表3)。头孢噻呋对照组对13株大肠埃希氏菌生物被膜形成的影响结果见表4。不同浓度头孢噻呋均可抑制分离菌株生物被膜的形成，头孢噻呋几乎不影响大肠埃希氏菌ATCC 25922生物被膜的形成。

3 讨论

大肠埃希氏菌在环境中广泛存在，能通过复杂的生存机制避免外部因素的影响[11]。生物被膜是是细菌为了适应周围环境所形成的与浮游状态相对应的存在方式，90%以上的微生物以生物被膜形式生长[12]。生物被膜形成后，细菌耐药性比浮游菌提高10倍～1 000倍，还会缓慢向周围环境释放浮游菌引发慢性感染，从而导致持续性炎症和组织损伤[13]。因此，寻找抑制细菌生物被膜形成的药物迫在眉睫。

表2 12株大肠埃希氏菌生物被膜形成能力

表3钩藤对多重耐药大肠埃希氏菌生物被膜形成的影响

表4头孢噻呋对多重耐药大肠埃希氏菌生物被膜形成的影响

钩藤为茜草科钩藤属常绿藤本植物，其主要成分包括生物碱、黄酮类、萜类、酯类等，其中钩藤碱是钩藤中含量较多，也是重要的活性成分[14]。目前国内外对钩藤的研究多涉及其活性成分研究、抗炎及对神经系统的作用，缺乏对细菌生物被膜的研究。钩藤对布鲁氏菌、大肠埃希氏菌具有良好的抑菌活性[15-16]。本试验受试分离菌株表现为多重耐药性，而在本研究的药物敏感性试验结果显示，钩藤对临床分离的耐药大肠埃希氏菌具有良好的抗菌活性，且呈现质量浓度的依赖性。亚抑菌浓度的钩藤即可抑制耐药细菌的生长。MIC浓度的钩藤几乎可以完全抑制细菌的生长，与已有研究结论一致[16]。虽然MIC浓度比抗生素大，但使用抗生素容易产生耐药性。本钩藤不仅单用时对多重耐药大肠埃希氏菌具有抗菌活性，与头孢噻呋联合应用时，对30.8%的受试菌株表现为协同作用，对61.5%的受试菌株表现为相加作用。

许多中药对细菌生物被膜的形成有抑制作用[17-19]。抗生素和中药联合应用可以有效对抗细菌的生物被膜，并可减少抗生素用量和毒性，延缓耐药性的产生[20]。本试验中的12株受试分离菌株均具有中等强度产膜能力，其中强成膜能力菌株8株，在钩藤对大肠埃希氏菌生物被膜形成的影响试验中，钩藤对于69.2%的受试大肠埃希氏菌生物被膜的形成具有抑制作用，并呈现浓度依赖性。钩藤对于强成膜能力的大肠埃希氏菌的生物被膜具有较好的抑制作用，个别受试菌株的OD570nm值的变化会随药物浓度的提高而出现升高现象，其原因可能是钩藤所含成分复杂，如生物碱类、黄酮类、萜类、酯类及多糖等，其中钩藤碱具有抑菌作用，而其丰富的植物多糖则可能被细菌利用，进而影响其对生物被膜的抑制作用。

钩藤对肉鸡源大肠埃希氏菌临床分离株有一定程度的抗菌活性，且能抑制大肠埃希氏菌生物被膜的形成，与头孢噻呋联合应用时，具有不同程度的协同抗菌作用，为解决畜禽养殖业大肠埃希氏菌的耐药性提供科学依据。