牛结节性皮肤病病毒在BHK-21细胞中的生长特性分析

马春玲，蔺玉刚，杨 雪，龚真莉，岳亚辉，任善会，王相伟，杨增岐，殷相平，孙跃峰，陈豪泰，万学瑞*

(1.甘肃农业大学，甘肃兰州 730070；2.新疆塔里木大学，新疆阿拉尔 843300；3.中国农业科学院兰州兽医研究所，甘肃兰州 730016；4.西北农林科技大学，陕西杨凌 712100)

牛结节性皮肤病(Lumpy skin disease，LSD)又称牛结节疹、牛结节性皮炎或牛疙瘩皮肤病，是由痘病毒科(Poxviridae)羊痘病毒属(Capripoxvirus，CaPV)牛结节性皮肤病病毒(Lumpy skin disease virus，LSDV)引起的一种牛的急性、亚急性传染病[1-2]。LSDV主要传播途径是通过蚊虫叮咬和机械性接触进行传播，主要引起牛头、颈、肩和乳房等处发生炎症反应，会引起牛发热、丘疹或皮肤结节，严重时形成脓疱状损伤及组织发生坏死结痂。目前，缺少针对LSDV 病原体的有效疫苗及防治措施。

世界动物卫生组织(OIE)将LSD列为必须报告的动物疫病，LSD也是《中华人民共和国进境动物检疫疫病名录》 中的二类传染病[3]。该疫病在1929年首次出现于赞比亚共和国，其后疫情迅速向中东、东欧和中亚等国家地区蔓延[1-2]。2019年8月12日，中国动物卫生与流行病学中心-国家外来动物疫病研究中心确诊我国新疆维吾尔自治区伊犁州发生LSD，这是我国首次报道LSD疫情。

有研究指出LSDV能在牛肾细胞(MDBK)、非洲绿猴肾脏细胞(Vero)、绵羊睾丸细胞(ovis aries testis,OA3.Ts)、原代羊睾丸细胞和绵阳胚胎皮细胞(ESH-L)中复制传播[4-5]。幼龄仓鼠肾脏细胞(BHK-21)是多种动物病毒的易感细胞系。BHK-21细胞易于规模化培养，是多种动物病毒疫苗生产常用的细胞模型，该细胞经过驯服后可以悬浮培养，且已成功应用于多种兽用疫苗的工业化生产过程[6-7]。虽然减毒重组的LSDV病毒能够在BHK-21细胞中成功复制[8]，但是否国内流行的LSDV野生型毒株也能够在BHK-21细胞中复制，LSDV在BHK-21细胞中的复制是否存在毒株及细胞品系的差异，需要进一步研究确定。

考虑到BHK-21细胞模型在动物疫苗生产及动物病毒研究中的重要功能，本试验用我国流行的LSDV野毒株，探究LSDV对BHK-21细胞的易感性，进而明确LSDV在BHK-21细胞中的生物学特性，期望为后期小鼠动物模型的建立及弱毒疫苗的研制奠定前期理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要试剂 LSDV ORF123及ORF29单克隆抗体,中国农业科学院兰州兽医研究所草食动物病毒病团队实验室制备保存；胎牛血清(FBS,货号CF602)，诺莱生物有限公司产品；DMEM培养基(货号66001-20012)，健硕生物科技有限公司产品；支原体检测试剂盒(货号40601ES20)，上海翊圣生物有限公司产品；40 mL/L多聚甲醛(货号P1110)和25 mL/L戊二醛电镜固定液(货号P1126)，北京索莱宝科技有限公司产品； Alexa Fluor 568 goat anti-Mouse IgG荧光二抗(货号B40942)，Invitrogen公司产品。

1.1.2 细胞和病毒 BHK-21细胞,中国农业科学院兰州兽医研究所草食动物病毒病团队保存提供；LSDV毒株(LSDV/FJ/CHA/2021毒株)兰州兽医研究所草食动物病毒病团队分离保存。BHK-21细胞系及LSDV毒株均经过支原体检测为阴性。

1.1.3 主要仪器设备 Bio-Rad蛋白印迹电泳仪及转膜槽(货号1703930)，广州威佳科技有限公司产品；透射电子显微镜(型号HT770)，上海日立电子有限公司产品；莱卡TCS SP8 MP多光子显微镜(型号TCS SP8)，德国莱卡仪器有限公司产品。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养接毒 将BHK-21细胞传代与9瓶T25培养瓶中，待细胞生长覆盖率达到90%～100%时，将其中8瓶BHK-21接种LSDV/FJ/CHA/2021毒株，攻毒剂量为1×107TCID50/mL，将其中1瓶细胞作为空白对照，置37℃和5% CO2条件的培养箱培养，标记日期。随后，每日拍照观察细胞状态和形态变化，整个试验期间确保细胞营养状态良好，连续观察8 d。

1.2.2 透射电镜观察 将细胞接种于直径T75细胞瓶中，在细胞达到培养瓶的70%～80%时，接毒种LSDV/FJ/CHA/2021毒株。待感染后第5天，加入适量4℃预冷的PBS，洗涤细胞2次，接着用细胞刮沿着一个方向轻轻将细胞刮下，转移到1.5 mL离心管中，1 000 r/min离心5 min。轻轻加入预冷的25 mL/L戊二醛混合液固定，4℃冰箱中静置过夜。第2天送交电镜处理室进行处理。待检测样品制备后，放于透射电子显微镜(HT770，日立电子)观察并拍照。

1.2.3 蛋白免疫印迹 病毒感染试验完毕后，连续8 d收集BHK-21细胞并裂解提取总蛋白，获得已感染LSDV的蛋白样品，将样品置100℃金属浴15 min煮沸处理后使蛋白变性，进行蛋白质免疫印迹。用SDS-PAGE凝胶电泳进行蛋白质分离并转印到NC膜上，转印结束后，用50 g/L脱脂奶粉室温封闭1 h。用LSDV ORF123和ORF29单克隆抗体进行内源性病毒蛋白检测，内参对照选择β-actin。最后用免疫印迹方法分析蛋白表达情况。

1.2.4 间接免疫荧光(IFA) LSDV(LSDV/FJ/CHA/2021毒株)感染BHK-21细胞，在感染后第3天，收集IFA样品。PBS清洗后用40 mL/L多聚甲醛4℃条件下，固定1 h，用5 mL/L Triton X-100透化10 min，用50 g/L BSA于37°C恒温箱封闭1 h，LSDV ORF123单克隆抗体(1∶1000)在37℃条件下孵育 3 h后，用Alexa Fluor 594 goat anti-Mouse IgG荧光二抗(1∶1000)孵育1 h，最后用DAPI(1∶1000)染色细胞核，用抗淬灭剂封片，过夜干燥后，用莱卡激光共聚焦显微镜，观察并拍照。

1.2.5 BHK-21细胞培养液上清中病毒含量的测定 将冻存在-80℃冰箱中的LSDV感染BHK-21的细胞培养液上清样品，进行10-1～10-11细胞毒稀释，加入到已经铺好BHK-21细胞的96孔板，逐日观察并记录LSDV在BHK-21细胞上的生长特性，计算TCID50，利用GraphPad软件绘制LSDV生长曲线。

1.2.6 生物安全声明 LSD感染的相关实验均在中国农业科学院兰州兽医研究所完成，整个试验过程严格按照中国农业科学院兰州兽医研究所的3级生物安全实验室的操作指南进行。

2 结果

2.1 LSDV感染BHK-21细胞诱导的细胞病变观察结果

相较于阴性照组(Mock组)BHK-21细胞呈柳叶形，LSDV接毒感染的第2天BHK-21细胞核周围汇聚及肿胀皱缩现象(白色箭头所指)。细胞接毒感染到第4天后，细胞核周围的染色质发生明显凝聚，部分细胞脱落和大量崩解，最后形成多个待脱落的细胞团(图1)。表明LSDV感染能够在BHK-21细胞中产生细胞聚集、细胞皱缩及细胞脱落的典型细胞病变，提示LSDV能够成功感染BHK-21细胞。

2.2 LSDV能够在BHK-21细胞中建立高效复制

为了进一步确定LSDV能够感染BHK-21细胞，用病毒的特异性单克隆抗体检测感染LSDV的BHK-21细胞中的LSDV ORF123和LSDV ORF29蛋白表达变化，发现在23 ku～40 ku能够检测到病毒蛋白的特异性条带(图2)，呈现时间依赖性增加，蛋白大小与预期结果相符，证明LSDV病毒蛋白获得了良好的表达，而且也具有良好的反应原性。通过测定LSDV感染BHK-21细胞TCID50绘制生长曲线，生长曲线结果表明LSDV能够在BHK-21中高效复制，该结果同图3细胞内LSDV ORF123和ORF29蛋白条带与β-actin的灰度扫描的结果相一致。BHK21细胞培养上清中的病毒含量在第7天最高，达到复制的平台期(图4)。

为了进一步证明LSDV能够感染BHK-21细胞，用IFA方法检测在BHK-21细胞中LSDV ORF123蛋白表达的细胞定位(图5)，在感染LSDV 3 d后的BHK-21细胞内中有大量点状红色荧光，表明LSDV ORF123病毒蛋白在BHK-21细胞中获得了良好的表达且位于细胞质。结果表明国内流行的LSDV/FJ/CHA/2021毒株能够在鼠源BHK-21细胞中成功感染并高效复制。

a.空白对照; b.LSDV感染第2天; c.LSDV感染第4天; d.LSDV感染第6天

M.蛋白分子质量标准; 0.空白对照组; 1～8.LSDV 感染天数; a.LSDV ORF29蛋白; b.LSDV ORF123蛋白; c.内参β-actin蛋白

2.3 BHK-21细胞内LSDV病毒工厂及病毒粒子形态观察

LSDV是大的双链有囊膜DNA病毒，呈现典型的“砖型”或“大卵圆型”病毒粒子，大小约360 nm×270 nm×250 nm。为了观察LSDV在BHK-21细胞中的病毒粒子形态及病毒工厂位置，用透射电镜对LSDV感染BHK-21细胞的病毒复制工厂和各种病毒粒子形态进行观察。图6可清晰观察到位于细胞质中的“病毒工厂”(白色圆圈线)。也能够在BHK-21细胞(1、2和3)中清晰观察到位于LSDV病毒工厂内部的各种未成熟病毒粒子形态。同时，在BHK-21细胞(图7)病毒工厂中，可观察到典型的“砖型”或“大卵圆型”胞内成熟的病毒粒子。

图3 LSDV在BHK21中ORF123和ORF29蛋白的灰度扫描

图4 BHK-21细胞培养上清中LSDV滴度的一步生长曲线

成熟病毒粒子呈双凹面核心体、两个侧小体、外面还有一层细胞囊膜，后者呈桶形，囊膜内含有病毒特异性蛋白质，囊膜外表呈皱褶状，形成不规则的突起(图7)。病毒粒子内部的双凹面核心体呈哑铃状，病毒基因组集中在核心体中，核心的外壁由两层蛋白外膜组成。内膜层是连续的，有一定数量的通道，内膜厚度和密度与质膜相似。外层膜结构类似栅栏结构，有钉子形状物镶嵌在内层膜上。透射电镜观察结果表明，LSDV的“病毒工厂”位于感染细胞的“细胞质”。

a.细胞核; b.细胞质; c.细胞核与细胞质合并; (1) 牛结节性皮肤病病毒ORF123蛋白

a.病毒学工厂; 1～3.LSDV病毒工厂内部的各种未成熟病毒粒子; b.未成熟病毒粒子

(a).LSDV病毒工厂内部的各种成熟病毒粒子; (1～3).成熟的病毒粒子(a).The mature virions in the viral factory; 1-3.The mature virions

3 讨论

LSDV与牛痘病毒(Cowpox virus，CPXV)差异很大，而与绵羊痘病毒(Sheep pox virus，SPPV)和山羊痘病毒(Goat pox virus，GTPV)相似，同属于羊痘病属(CaPV)[9]。目前，针对LSDV感染的致病机制和免疫逃逸研究较少，缺少针对该疫病的特异性疫苗和较好的治疗方法与手段。

针对LSDV的研究大部分集中在MDBK细胞、Vero细胞、OA3.Ts细胞和ESH-L等细胞中开展[4-5]。BHK-21细胞模型具有易于培养、传代快以及可以无血清悬浮培养的特性，而且已被广泛的应用在多种动物病毒感染及疫苗生产制备过程，如口蹄疫病毒[6]、狂犬病病毒[7]和新城疫病毒[10]的研制。考虑到BHK-21细胞模型的优良特性和广泛适用性，本研究利用BHK-21细胞培养LSDV，结果证实国内流行的LSDV野毒株能够感染BHK-21细胞，蛋白免疫印迹和生长曲线结果表明细胞内和细胞外的LSDV病毒呈现时间依赖性的方式进行高效复制。研究结果为利用BHK-21悬浮扩大培养，用于LSDV灭活疫苗及小鼠动物模型的建立提供了理论基础。

近年对于痘病毒生物学特性的大部分知识储备来自于针对痘苗病毒(Vaccinia virus，VACV)的研究中[12-16]，特异性针对LSDV生物学特性的研究较少。基于双脱氧测序方法，有研究绘制了LSDV(Neethling 2490毒株，GenBank数据库登录号为AF325528.1)的基因组结构示意图，编码大约156个开放性阅读框[11]。病毒工厂是由宿主细胞的细胞器膜的广泛重排而构成的隔间区间，位于细胞质或细胞核。研究表明细小病毒等较小的DNA病毒的复制需要宿主“细胞核”内的复制体系支持。然而，较大的痘苗病毒(VACV)由于自身携带完整的DNA合成系统，不依赖宿主细胞的复制体系，而是利用病毒的DNA聚合酶，可以在没有宿主复制体系的“细胞浆”内复制[12]。对于成熟的VACV来说，可以直接和细胞膜进行融合，也可以通过巨胞饮内吞进细胞，在宿主细胞“内体”里病毒的外膜与“内体”膜融合释放出内膜包绕的病毒核心。释放出来的病毒核心可以发生脱壳，将病毒的基因组释放出来。VACV脱壳之后释放DNA，在DNA聚合酶和RNA聚合酶的作用下，在病毒复制工厂内进行早期、中期和晚期基因组蛋白的转录与翻译。 VACA的病毒工厂位于“细胞质”内的一些内膜的孔洞内，在闭合的孔洞中VACA病毒粒子进一步成熟，形成典型的痘病毒的哑铃形态[12]。LSDV能够成功的在易感宿主细胞质内的“病毒工厂”建立高效感染与复制的每个过程，是一个精密严谨且复杂的生物学过程。本研究透射电镜结果表明，相似于VACV，痘病毒科羊痘病毒属中的LSDV不依赖于宿主复制系统，而是依赖于病毒编码的DNA依赖的RNA聚合酶，在“细胞质”内的“病毒工厂”中高效复制，进行“早期、中期和晚期”病毒蛋白的转录与复制，繁衍子代病毒[12]。成熟的LSDV粒子外观呈现典型“砖型”或“大卵圆型”。对于LSDV在易感宿主细胞质内是如何准确的完成病毒颗粒组装以及整个LSDV复制，周期过程中是如何实现病毒蛋白“早期、中期和晚期”的表达调控等一系列科学问题进行深入研究，将有助于人们更好地理解LSDV复制周期，有利于针对LSDV蛋白功能探寻新的药物靶点。