高效液相色谱法测定茶饮料中的咖啡因含量

宁 炜

（山西省检验检测中心(山西省标准计量技术研究院)，山西太原 030012）

咖啡因，又称咖啡碱，是一种从咖啡或茶叶中提取的黄嘌呤生物碱化合物，具有使人体中枢神经系统兴奋的作用，适度使用可以祛除疲劳、振奋精神，然而长期或超剂量摄入会对人体肝肾功能造成损害，而且其具有成瘾性，停用后会出现身体疲乏、精神不振等症状[1-4]。近年来，含咖啡因成分的咖啡、茶饮料、功能性饮料等十分畅销，市场调研发现，许多茶饮料都使用了咖啡因食品添加剂，且茶叶的加入也有原料带入的可能，因此茶饮料中咖啡因的检测十分必要[5-7]。《茶饮料》（GB/T 21733—2008）[8]中对各类茶饮料中的咖啡因含量均有相关规定。《食品安全国家标准 饮料中咖啡因的测定》 （GB 5009.139—2014）[9]中规定了高效液相色谱法测定可乐型饮料、咖啡、茶饮料中咖啡因的检测方法，推荐使用紫外检测器（Ultraviolet Absorption Detector，UVD）或二极管阵列检测器（Diode Array Detector，DAD），其中DAD检测器能够进行全波长光谱扫描，更有助于准确定性，减少假阳性误判。基于此，本研究参照GB 5009.139—2014，建立了高效液相色谱-二极管阵列检测器测定茶饮料中咖啡因含量的分析方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

某品牌茶饮料购自某超市；咖啡因标准品（纯度99.9%，中国食品药品检定研究院）；甲醇（色谱纯，美国飞世尔试剂公司）；氧化镁（分析纯，天津市鼎盛鑫化工有限公司）；实验室用水为一级超纯水。

1.2 仪器与设备

LC-2030C 高效液相色谱仪（配二极管阵列检测器，日本岛津公司）；MS105DU电子天平（精度0.01 mg，瑞士梅特勒托利多公司）；XS204电子天平（精度 0.1 mg，瑞士梅特勒托利多公司）；KQ5200DE超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；0.45 μm微孔水相滤膜（天津津腾实验设备有限公司）；Synergy超纯水机（德国密理博公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 标准溶液配制

（1）标准储备液配制。精密称取19.65 mg咖啡因标准品于10 mL容量瓶中，用甲醇稀释、定容至刻度，配制成质量浓度为1963.04 μg/mL的咖啡因标准储备液。

（2）标准中间液配制。准确吸取1.0 mL咖啡因标准储备液于10 mL容量瓶中，用超纯水稀释、定容至刻度，配制成质量浓度为196.30 μg/mL的咖啡因标准中间液。

（3）标准工作液配制。准确吸取0.3 mL咖啡因标准储备液于10 mL容量瓶中，用超纯水定容至刻度，配成浓度为58.89 μg/mL的标准溶液；分别吸取 0.1 mL、0.25 mL、0.5 mL和1.0 mL咖啡因标准工作液于10 mL容量瓶中，用超纯水定容得标准系列浓度分别为1.96 μg/mL、4.91 μg/mL、9.82 μg/mL和19.63 μg/mL；分别吸取0.03 mL、0.10 mL、0.20 mL及0.50 mL浓度为19.63 μg/mL的标准溶液于10 mL容量瓶中，用超纯水定容得标准系列溶液浓度分别 为0.059 μg/mL、0.200 μg/mL、0.390 μg/mL及 0.980 μg/mL。

1.3.2 试样处理过程

精密称取5 g样品于10 mL比色管中，加入超纯水定容至5 mL，摇匀，加入0.5 g氧化镁，振摇，静置，取上清液经微孔滤膜过滤，上机检测。

1.4 液相色谱条件

色谱柱：艾杰尔Promosil C18色谱柱（250 mm× 4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇+水（24+76），等度洗脱；流速：1.0 mL/min；柱温：30 ℃；DAD检测器波长：272 nm；进样量：10 μL。

2 结果与分析

2.1 线性关系考察

分别将配制的质量浓度为0.059 μg/mL、 0.200 μg/mL、0.390 μg/mL、0.980 μg/mL及1.960 μg/mL 的标准系列溶液与质量浓度为4.91 μg/mL、 9.82 μg/mL、19.63 μg/mL、58.89 μg/mL及196.30 μg/mL 的标准系列溶液按照1.4液相色谱条件上机测试，以咖啡因的质量浓度（x）为横坐标，以其对应测得的色谱峰面积（y）为纵坐标，绘制标准工作曲线，计算曲线方程和线性系数。由表1可知，咖啡因在0.059～1.960 μg/mL与4.91～196.30 μg/mL均表现出良好的线性关系，相关系数均大于0.999。

表1 咖啡因的线性范围、曲线方程和线性系数

2.2 加标回收率与重复性

准确称取9份阴性茶饮料，结合方法的线性范围向1～3号试样中添加0.5 mL浓度为1.96 μg/mL的咖啡因标准溶液，4～6号试样中添加0.15 mL浓度为1963.04 μg/mL的咖啡因标准溶液，7～9号试样中添加0.30 mL浓度为1963.04 μg/mL的咖啡因标准溶液，按照1.3.2试样处理过程操作，1.4液相色谱条件测试，计算方法的加标回收率。由表2可知，茶饮料中咖啡因在0.196～117.782 mg/kg添加水平下，回收率为96.43%～103.31%。向阴性茶饮料中添加 0.15 mL浓度为1963.04 μg/mL的咖啡因标准溶液，平行测定6次，考察方法的重复性（用相对标准偏差RSD表示），方法的重复性RSD为1.56%，具体见表3。由此可见，方法的加标回收率与重复性均满足GB/T 27404—2008[10]中的规定，测定结果准确可靠。

表2 咖啡因的加标回收试验结果统计（n=3）

表3 咖啡因的重复性验证结果统计（n=6）

2.3 检出限与定量限

精密称取5 g阴性茶饮料，加入0.15 mL浓度为1.96 μg/mL的咖啡因标准溶液，按照1.3.2试样处理过程操作，1.4液相色谱条件测试，测得色谱峰响应值大于3倍噪音，计算得出方法的检出限为 0.059 mg/kg。根据加标回收率试验中低浓度回收率结果可知中该方法中咖啡因定量限为0.2 mg/kg。

3 结论

本研究参照GB 5009.139—2014，建立了高效液相色谱-二极管阵列检测器测定茶饮料中咖啡因含量的分析方法。该方法前处理过程简便，Promosil C18色谱柱分离效果好，分析速度快，使用二极管阵列检测器可以进行准确定性定量，经过方法学验证，该方法线性关系良好，加标回收率和精密度、检出限与定量限等均符合相关标准要求，可以满足检验检测机构对茶饮料中咖啡因的批量快速检测。