IgG4水平在磷脂酶A2受体相关膜性肾病病情活动及疗效判断中的临床意义

杜园园，姜 雪，王文荣，汤绚丽，孙 玥

浙江中医药大学附属杭州市中医院肾内科 浙江省肾脏疾病防治技术研究重点实验室，杭州 310007

膜性肾病是一种自身免疫性疾病，是导致成人肾病综合征的常见病因，按照发病原因可分为特发性膜性肾病(idiopathic membranous nephropathy，IMN)和继发性膜性肾病(secondary membranous nephropathy，SMN)。Beck等[1- 2]鉴定出磷脂酶A2受体(phospholipase A2 receptor，PLA2R)是IMN的潜在靶抗原，约70%的IMN由PLA2R介导免疫反应而致病。因此，有学者将这一类膜性肾病称为PLA2R相关膜性肾病(PLA2R-associated membranous nephropathy，PLA2R-MN)[3]。Beck等[1]在发现PLA2R的同时，发现从肾小球免疫复合物和血清中检测到的抗体以IgG4为主，之后的多项研究[4- 6]也证实了这一点，在SMN、非免疫性肾小球疾病、自身免疫性疾病和正常人群中很少或未检测到这种抗体[7]，提示IgG4与PLA2R-MN的发病密切相关。本研究比较PLA2R-MN患者肾穿刺时血清和尿液IgG4水平，并且随访PLA2R-MN患者治疗1年后血、尿IgG4水平与疾病转归的相关性，从而探讨IgG4作为反映PLA2R-MN病情活动和治疗预后的生物学指标的可能性。

对象和方法

对象选取2017年4月至2018年1月杭州市中医院肾内科经肾活检确诊的PLA2R-MN 患者56例，SMN患者13例和IgA肾病(IgA nephropathy，IgAN)患者10例。PLA2R-MN患者肾组织PLA2R抗原检测均为阳性及排除SMN(包括肿瘤相关性膜性肾病、乙肝病毒相关性膜性肾病、狼疮性膜性肾病、药物及毒素相关性膜性肾病)，SMN肾组织PLA2R抗原检测均为阴性(包括2例狼疮性膜性肾病、2例干燥综合征继发膜性肾病、1例乙肝病毒相关性膜性肾病、8例原因未明的不典型膜性肾病等)，IgAN患者排除继发性IgAN(包括过敏性紫癜性肾炎、系统性红斑狼疮、干燥综合征、强直性脊柱炎、酒精性肝硬化和慢性肝病等疾病)。

一般实验指标检测包括24 h尿蛋白定量、血清白蛋白、肝功能、肾功能、血糖、血脂、尿酸、抗可提取性抗原多肽抗体谱、抗核抗体、肿瘤标志物(糖类抗原125、糖类抗原199、癌胚抗原等)及感染性疾病筛查。

肾组织标本的采集和检测所有患者在超声实时引导下行经皮肾穿刺活检术，所取肾组织必须行免疫荧光、光学显微镜及电子显微镜检查。

肾小球IgG4亚型检测：采用异硫氰酸氟荧光素偶联小鼠单克隆抗体，通过直接免疫荧光显微镜检测肾小球IgG亚类沉积，免疫荧光染色强度从-到+++ (-阴性，+弱染色，++中染色，+++强染色)分级。

肾小球PLA2R表达：石蜡切片进行PLA2R免疫染色，采用柠檬酸溶液和胃酶提取抗原，采用Elivision系统进行免疫组织化学检测。

电子显微镜检查：根据Ehrenreich Churg分类法对膜性肾病的超微结构结果进行分期。

IgG和IgG4水平的检测收集PLA2R-MN、SMN、IgAN患者肾活检当天，并且未曾接受激素或免疫抑制剂治疗的血和尿标本。考虑到部分膜性肾病患者由于尿液中IgG排泄或免疫功能紊乱导致血IgG水平下降，随机尿IgG4水平易受饮水量引起的尿液不同程度稀释的影响，所有血清值用血IgG校正，所有尿值用尿肌酐校正。血IgG4/lgG由IgG4的浓度除以lgG的浓度获得，IgG4/尿肌酐由IgG4的浓度除以尿肌酐的浓度获得。

IgG4：具体操作严格按试剂盒说明书进行(试剂盒由上海西唐生物科技有限公司提供)。

IgG：采用散色比浊法，利用BN系统自动完成血标本IgG检测。

治疗评估标准完全缓解：治疗后24 h尿蛋白<0.3 g/L，血清白蛋白>40 g/L；部分缓解：治疗后尿蛋白下降>50%，且每24 h尿蛋白为0.5～3.5 g，血清白蛋白>35 g/L；未缓解：治疗后未达上述指标。

随访所有患者均随访1年以上，收集患者肾穿刺1年后血、尿标本，检测血尿IgG4、IgG、尿肌酐。

统计学处理采用SPSS 26.0统计软件包，符合正态分布的计量资料以均数±标准差表示，组间比较采用方差分析；不符合正态分布的计量资料以M(Q1，Q3)表示，组间比较采用非参数检验，多组等级变量之间的比较采用Kruskal WallisD检验，两组等级变量之间的检验采用Mann-WhitneyU检验。计数资料采用卡方检验。相关系数采用Spearman相关检验。P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

一般情况56例PLA2R-MN患者中，32例表现为肾病综合征或肾病范围蛋白尿，24例表现为非肾病水平蛋白尿；5例表现为肾功能不全(估算肾小球滤过率<60 ml/min)，51例肾功能正常；37例血清白蛋白<30 g/L，19例血清白蛋白≥30 g/L；21例病理表现为Ⅰ期膜性肾病，29例为Ⅱ期膜性肾病，6例为Ⅲ期膜性肾病。13例SMN患者中，4例表现为肾病综合征或肾病范围蛋白尿，9例表现为非肾病水平蛋白尿。10例IgAN患者均表现为非肾病水平蛋白尿。与PLA2R-MN患者相比，SMN患者的性别比例、年龄、尿蛋白定量、血清白蛋白及血肌酐水平差异均无统计学意义(P均>0.05)；IgAN患者的年龄、尿蛋白定量均明显下降(P<0.001，P=0.021)，血清白蛋白及血肌酐水平均明显升高(P<0.001，P=0.017)。与SMN患者相比，IgAN患者的年龄明显降低(P=0.005)，血清白蛋白水平明显升高(P<0.001)(表1)。

血IgG4/IgG和尿IgG4/尿肌酐PLA2R-MN患者血IgG4/IgG比值均显著高于SMN及IgAN患者(P=0.009，P<0.001)，尿IgG4/尿肌酐均显著高于SMN患者(P=0.008)(表2)。

PLA2R-MN中尿蛋白≥3.5 g/24 h患者血清IgG4/IgG比值有高于尿蛋白<3.5 g/24 h者的趋势，但差异无统计学意义(P=0.059)。肾功能不全组血清IgG4/IgG比值和尿IgG4/尿肌酐比值明显高于肾功能正常组(P=0.049，P=0.015)。血清白蛋白水平<30 g/L者血清IgG4/IgG比值明显高于血清白蛋白水平≥30 g/L者(P=0.005)。血清IgG4/IgG比值随病理分期有逐渐升高趋势，但差异无统计学意义(P=0.524)(表3)。

53例PLA2R-MN患者至少随访1年，3例患者失访，发现11例患者未缓解，42例患者获得完全或部分缓解后，血清白蛋白从(29.0±6.2) g/L上升至(37.3±5.24) g/L。缓解组肾穿刺时基线血清IgG4/IgG明显低于未缓解组(P=0.005)(表4)。

表1 各组患者的临床特征比较

表2 各组血IgG4/lgG及尿IgG4/尿肌酐的比较[M(Q1，Q3)]

表3 PLA2R-MN患者不同临床表现时血清IgG4/IgG和尿IgG4/肌酐的比较[M(Q1，Q3)]

表4 PLA2R-MN患者不同转归时血清IgG4/IgG和尿IgG4/肌酐的比较[M(Q1，Q3)]

随访1年后，采集到27例PLA2R-MN患者的血清标本，其中包括23例缓解患者及4例未缓解患者。缓解期患者血清IgG4/IgG中位数比值显著降低(P<0.001)，未缓解者血清IgG4/IgG中位数比值差异无统计学意义(P=0.483)。仅9例PLA2R-MN患者采集到尿标本。其中7例缓解，2例未缓解。缓解组患者中位尿IgG4/肌酐比值随访前后差异无统计学意义(P=0.499)(表5)。

表5 治疗前后血IgG4/IgG及尿IgG4/肌酐水平的比较[M(Q1，Q3)]

相关性根据血清IgG4/IgG绘制受试者工作特征曲线，比较有无缓解患者的预后，受试者工作特征曲线下面积为0.775 (P=0.005)，截止值为10.24%(图1)。Spearman相关性分析显示，PLA2R-MN患者血清IgG4和尿液IgG4水平呈显著相关性(rs=0.602，P<0.001)。

讨 论

IMN是一种由内源性抗原引起原位免疫复合物形成的自身免疫性疾病，其主要抗原为PLA2R，IgG4是抗PLA2R的主要抗体，IgG4与足细胞上的PLA2R特异性结合形成优势沉积，并通过激活甘露糖结合凝集素途径或旁路途径，产生C5- 9膜攻击复合物，损伤足细胞，参与IMN的发病过程[8- 9]。IgG4是IgG亚类中比率最小的一种亚型，占血清总IgG水平的3%～4%。在PLA2R-MN患者中，IgG4做为抗PLA2R抗体的主要成分，在IgG中的比值有所升高。Kuroki等[10]通过ELISA法检测血IgG4、IgG水平，发现IMN患者血中

图1 血清IgG4/IgG判断PLA2R-MN患者预后的受试者工作特征曲线

IgG4占总IgG的比率(即IgG4/IgG)高于膜型狼疮性肾炎、膜增生性肾小球肾炎及健康对照者。国内Li等[11]研究显示IMN患者血和尿IgG4/IgG均显著高于微小病变性肾病、局灶节段硬化性肾小球肾炎和健康志愿者。IgG4较其他IgG亚型有其独特的结构和电荷特性，IgG4与抗原形成的免疫复合物是小分子量，IgG4带有负电荷，与肾小球基底膜的负电荷相斥，使得其亲和力较低，容易解离而出现在患者尿液中[12]，因此，尿IgG4水平除了可能和血IgG4水平相关外，还与肾脏组织免疫复合物中IgG4沉积多少及清除等相关。SMN的肾组织中未发现IgG4沉积为主[13- 14]。而IgAN患者肾小球足细胞中没有PLA2R和相关IgG4沉积，因此将其作为本研究的另一对照组。

本研究显示，PLA2R-MN患者血清IgG4/IgG比值、尿IgG4/肌酐比值均显著高于SMN患者，血清IgG4/IgG比值显著高于IgAN患者，与既往研究[10- 11]结果一致。而SMN组与IgAN组之间差异无统计学意义，提示检测血清IgG4/IgG比值和尿IgG4/尿肌酐比值可作为诊断IMN的一种简便、无创的方法。IgG4是70% IMN患者PLA2R抗体的主要IgG亚类，因此，进一步检测抗PLA2R的血、尿IgG4水平可能是诊断IMN的较目前常用的检测血PLA2R-IgG水平更准确的一种无创手段，可以提高诊断的敏感性。

本研究显示PLA2R相关膜性肾病患者缓解后血清IgG4/IgG比值明显降低，无缓解患者血清IgG4/IgG比值无下降。此外，血清白蛋白≥30 g/L的患者其血清IgG4/IgG比例和尿IgG4/肌酐比值明显低于IMN患者血清白蛋白<30 g/L的患者。肾功能正常的患者其血清IgG4/IgG比例明显低于肾功能不全的患者。这些结果证实IgG4在IMN的发病机制中发挥重要作用，提示血清IgG4/IgG比值与IMN疾病活动密切相关。

针对儿童IMN患者的研究显示，IgG呈节段性分布的以IgG1和IgG3为主，IgG呈全毛细血管襻分布的儿童IMN患者以IgG2和IgG4为主，提示IgG4的沉积可能与IMN的不同病程有关[15]。本研究按病理分期对IMN进行分类时，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期IMN患者血清IgG4和尿液IgG4差异无统计学意义，表明血清和尿液IgG4水平不能反映IMN肾脏病理的严重程度。

本研究观察治疗缓解组和未缓解组的血清和尿液IgG4水平的变化，在1年后进行分析，结果表明缓解组的患者血清IgG4/IgG比值较基线值明显下降，证实血清IgG4/IgG比值与IMN疾病活动性密切相关。随着疾病缓解和尿蛋白水平的提高，血清IgG4/IgG比值显著降低，证实IgG4可能在IMN发病机制中发挥重要作用。此外，本研究显示血清IgG4/IgG比值<10.24%的患者对治疗有更好的反应。因尿液样本量少，尿液IgG4/肌酐未得出有意义的结果。

进一步分析显示血清和尿液IgG4水平之间存在相关性，提示尿IgG4和经过肾小球滤过的血清IgG4浓度有关。然而，血清或尿液IgG4水平与IgG4在肾脏中的沉积之间无相关性，表明尿液IgG4可能与肾脏组织中IgG4的清除无相关性或合并其他干扰因素。

本研究的局限性包括样本量相对较小，特别是对照组的数量，以及随访时间有限。患者在随访期间的免疫抑制用药方案不同，可能会影响预后。后续应进行更大的人群调查和更长的随访时间。

综上，PLA2R-MN患者的血清和尿液IgG4水平发生改变，因此，它们可能是膜性肾病疾病活动的指标。此外，血清IgG4/IgG比值<10.24%的患者有更好的治疗反应，支持血清和尿液IgG4水平，特别是血清IgG4水平作为预测PLA2R-MN缓解的潜在生物标志物的潜力。