微小RNA甲基化在肝细胞癌诊疗中的研究进展

张宏龙，严 俊，2，3，4，5，李 汛，2，3，4，5

1兰州大学第一临床医学院，兰州 730000

2兰州大学第一医院普外科，兰州 730000

3甘肃省生物治疗与再生医学重点实验室，兰州 730000

4兰州大学医学院肿瘤防治中心，兰州 730000

5甘肃省肝胆胰外科研究所，兰州 730000

肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是全球第六大常见的癌症，在癌症相关死因中排名第三，每年导致约75万人死亡[1]。我国的乙型肝炎发病率很高，加之肝硬化、黄曲霉素感染、化学毒物的接触等，使中国的HCC病例占到了全球的47%[2]。由于HCC患者就诊时多处于晚期，给HCC的治疗增加了巨大困难，预后常较差，所以积极探索HCC发生发展、诊断预后和治疗的新策略至关重要。在过去10年中，表观遗传学修饰，尤其是启动子甲基化在HCC的发生发展中发挥重要作用，微小RNA(microRNA，miRNA)的CpG岛异常甲基化可以调节miRNA的表达，并影响其靶基因的表达和功能，进而控制肿瘤的生物学行为。下面将详细阐述miRNA甲基化在HCC的发生、诊断、预后和临床治疗中的近期关键发现，为肝癌的临床治疗提供新的思路。

miRNA甲基化概述

miRNA是一类包含约22个核苷酸的内源性非编码单链RNA，它们可以通过靶向互补特定的信使RNA(messenger RNA，mRNA)在基因表达的调节中发挥关键作用，从而导致mRNA降解或翻译过程抑制[3]。miRNA的成熟从初级miRNA(pri-miRNA)开始，然后由Drosha/DGCR8异二聚体在细胞核中加工产生前体miRNA(pre-miRNA)，随后与Exportin 5及其催化伴侣Ran-GTP结合使其从细胞核转运至细胞质中，被RNase Ⅲ型酶Dicer剪切成大约长22个核苷酸的成熟miRNA双链体，最后被解旋酶解螺旋产生有功能的单链miRNA[4]。越来越多的研究表明，miRNA的异常表达与多种疾病有关，包括癌症、炎症和自身免疫性疾病，并且可以作为早期筛查、预后和治疗的生物标志物应用于临床。

近年来，人们发现miRNA的表达受表观遗传的调控，如启动子甲基化或组蛋白修饰，与疾病的发生发展密切相关[5]。值得注意的是，大约50%的miRNA基因都与其CpG岛相关，这表明DNA甲基化在调节miRNA的表达中起着至关重要的作用[6]。异常的DNA甲基化可分为低甲基化和高甲基化，DNA低甲基化是指DNA甲基化的丧失，导致基因表达上调，相反，DNA高甲基化意味着先前未甲基化的位点获得甲基化标记，则导致稳定的转录沉默和减少的基因表达[4]。就像编码基因一样，DNA甲基化也可以通过甲基化miRNA启动子区域中的CpG岛来抑制miRNA的转录，进而影响许多疾病的状态[7]。

随着对肿瘤的研究日益深入，miRNA基因出现在与癌症相关的基因组区域中的现象屡见不鲜，并在其中扮演着癌基因与抑癌基因两个相反的角色[8]。miRNA在受DNA异常甲基化调节的过程中，癌基因和抑癌基因通过DNA低甲基化和高甲基化而分别激活和沉默，进一步阐明了肿瘤细胞癌变的机制[9]。

miRNA甲基化与HCC的发生发展

近年来，人们发现miRNA甲基化参与到HCC的发病当中。乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)和其他生物化学毒物通过使某些特定miRNA异常甲基化，促进HCC的发生。

miRNA甲基化参与HBV感染引起的HCC发生发展HBV感染引起的HCC病例占到了70%～80%，其中乙型肝炎病毒X蛋白(hepatitis B virus X protein，HBx)起着至关重要的作用。HBx可以调节表观遗传分子(包括miRNA、甲基化、乙酰化等)的表达和活性，从而导致多种途径和功能的紊乱[10]。

MiR- 132是由转录因子cAMP反应元件结合蛋白从17号染色体的基因间区转录而来的，已被证明在HCC中下调[11]。为了研究miR- 132在HCC进展的功能属性，有学者发现，miR- 132通过灭活Akt信号通路，特别是通过降低Akt磷酸化和细胞周期蛋白D1的浓度在HCC中发挥抑癌作用，并且与HCC中的HBx表达负相关。分析其原因可能是HBx与DNA甲基化转移酶(DNA methyltransferase，DNMT)结合，从而引起miR- 132启动子的超甲基化使其表达沉默，最终导致HCC的发生和加速进展[12]。MiR- 205已被发现在多种癌症中表达下调[13- 15]，同样在HCC组织中，miR- 205直接靶向HBx，通过抑制HBx的表达在HCC组织中起着抑癌作用。进一步研究表明HBx能够通过诱导miR- 205启动子的超甲基化来抑制miR- 205，从而消除了miR- 205的肿瘤抑制作用，增强肝癌细胞的生长[16]。除此之外，也有研究报道，miR- 137通过靶向抑制Notch1的表达，减弱HBx-siRNA处理的MHCC97H细胞增殖[17]。Notch1已被证明通过调节E-钙黏着蛋白而与HCC细胞中的血管生成和上皮-间质转化形成相关，进而促进HCC侵袭和复发[18-19]。而HBx可以通过诱导miR- 137的甲基化来下调miR- 137的表达，进而促进HCC的发生发展[17]。总的来说，HBx诱导的DNA甲基化导致miRNA表达的表观遗传抑制，为HBV介导的肝癌发生提供新的见解。

miRNA甲基化参与生物化学毒物引起HCC发生发展霉菌毒素是农作物中一种常见的致癌物，成为撒哈拉以南非洲肝癌发病的主要危险因素[20]。霉变玉米所含的霉菌毒素污染物镰刀菌酸(fusaric acid，FA)是一种对动植物均有毒性的真菌毒素[21]。为了探究表观遗传修饰是否在FA毒性中发挥关键作用，有研究指出，FA通过降低DNMT1/3A/3B的表达并增加DNA甲基化结构域2(methyl CpG binging domain protein 2，MBD2)的表达来诱导HepG2细胞中的整体DNA低甲基化，而整体DNA低甲基化则通过引起基因组不稳定和增加突变频率被认为是癌症的标志[22]，从而认为FA会导致包括肝癌在内多种肿瘤的发生。进一步的结果表明，FA通过使miR- 29b启动子区去甲基化进而上调HepG2细胞中miR- 29b的表达。而miR- 29b则可以直接靶向DNMT3A和DNMT3B，并通过抑制转录激活因子Sp1间接靶向DNMT1，从而下调DNMT1、DNMT3A和DNMT3B的表达，最终诱导整体DNA低甲基化改变，提供了FA诱导基因毒性和细胞毒性的表观遗传调控机制[23]。因此，miRNA甲基化可能作为一种新的机制参与FA诱导的整体DNA甲基化不足以促进肝癌发生。

除此之外，还有一些有机化学污染物会导致肝癌的发生。三氯乙烯(trichlorethylene，TCE)是一种被广泛用于工业的挥发性有机溶剂，并因污染空气、土壤和水源而受到人们关注。MiR- 182- 5p是一种致癌的miRNA，可以在包括肝癌在内的各种肿瘤中均过表达[24- 26]。研究表明，TCE暴露通过下调DNMT3A/3B导致miR- 182- 5p启动子区域的甲基化不足，从而使其过表达上调。而miR- 182- 5p的上调又会反过来抑制Cited2(一种肿瘤抑制因子)，Cited2增强细胞增殖并因此促进TCE肝癌的发生[27]。呋喃是一种广泛存在于烹饪食品中的重要化学污染物，国际癌症研究机构将其归为可能的人类致癌物[28]。miR- 375已被鉴定为一种抑癌miRNA，在包括肝癌在内的多种肿瘤中下调[29]。研究显示miR- 375在呋喃诱导肝癌发生中稳定下调，并与miR- 375结合的组蛋白H3K9和H3K27的基因特异性胞嘧啶DNA高度甲基化有关[30]。总之，表观遗传修饰在多种致癌物致肝癌发生的过程中发挥重要作用，miRNA甲基化可能是其中重要的一方面，在预防肝癌发生中值得更深入研究。

miRNA甲基化与HCC的临床诊断和预后

目前，甲胎蛋白(alpha-fetoprotein，AFP)仍是最广泛使用的肝癌血清生物标志物，在肝癌的筛查、诊断和预后评估中起着重要作用。然而，由于其在早期肝癌临床诊断的敏感性较低[31]，并且在慢性肝炎和肝硬化的血清中也常常升高[32- 33]，临床应用存在一定争议。幸运的是，研究发现肝癌的miRNA甲基化生物标志物可能有助于提高肝癌诊断和预后的准确性。

miRNA高甲基化与HCC诊断和预后的关系大量研究表明，许多miRNA在肝癌发生过程中作为抑癌基因，并且高甲基化诱导的miRNA表观遗传沉默可能是HCC癌变的潜在机制，参与肿瘤的生长、转移和血管生成[34]。

MiR- 200家族由位于染色体1p36(miR- 200a、miR- 200b和miR- 429)和染色体12p13.3(miR- 200c和miR- 141)上的5个成员组成[35]。它们被认为是上皮-间质转化的关键调节剂，导致肿瘤的侵袭和扩散，是原发性肿瘤向远处转移的重要一步[36]，并且CpG岛的DNA甲基化是引起miR- 200家族失调的机制之一。有相关研究指出，miR- 200b被DNA甲基化部分沉默，并可以通过直接靶向HCC中的BMI1和ZEB1来抑制肿瘤生长和侵袭[37- 38]。其次，基于超甲基化的miR- 200b表达下调与HCC患者频繁的复发(HR=2.49)和较高的死亡率(HR=2.76)显著相关，并且在诱导和维持癌症干细胞的肿瘤起始中发挥独特作用[38]。再者，lncRNA GIHCG被证明在HCC中高表达，并且高GIHCG表达与HCC患者较差的生存期相关。进一步探讨其机制，发现GIHCG表现出癌基因的作用是通过上调miR- 200b/a/429启动子H3K27三甲基化和DNA甲基化水平，并最终抑制miR- 200b/a/429的表达来促进HCC细胞的增殖和转移[39]。总之，miR- 200 DNA甲基化直接或间接与HCC的发生发展和预后相关，并且介导癌症干细胞干性调节是HCC干细胞临床治疗的潜在靶点。

除miR- 200家族之外，还有很多miRNA在HCC的发生发展中表现出相似的功能。MiR- 192启动子高度甲基化可能使miR- 192- 5p的表达沉默，维持肝癌干细胞特性，激活可能允许的亚肝细胞群体获得肿瘤起始能力，从而促进HCC的进展，导致HCC患者不良的预后[40]。MiR- 142在HCC中呈现出高甲基化状态，用甲基化抑制剂5-氮杂胞苷(5-azacytidine，5-Aza)可以恢复miR- 142的表达，以靶向抑制TGF-β依赖性肝癌增殖，上间-间质转化和促血管生成的能力，这也部分解释了miR- 142 表达降低与HCC不良临床结局相关的原因[41]。MiR- 639在肝癌细胞和组织中的表达水平均降低，这可以部分归因于DNMT3A对miR- 639启动子进行超甲基化，miR- 639的沉默减弱了其对MYST2和ZEB1的靶向抑制作用，增强了HCC细胞的增殖、迁移和侵袭[42]。另外，miR- 9、miR- 122、miR- 124、miR- 129、miR- 146等[43- 47]肿瘤抑制因子通过DNA高甲基化在HCC中均表达下调。miRNA甲基化与肝癌发生发展和预后密切相关，目前研究多集中在细胞水平，仍需要大样本临床资料验证DNA甲基化在HCC患者早期诊断和预后中的价值。

miRNA低甲基化与HCC诊断和预后的关系此外，在HCC组织和细胞中还可以检测到DNA低甲基化诱导的多种miRNA过表达，它们充当致癌基因促进HCC的发生发展，并作为生物标志物参与肝癌的诊断和预后，还是肝癌治疗的潜在靶点，具有重大意义。

已有研究报道，19号染色体miRNA簇(C19MC)含有59个成熟的miRNA，是HCC的关键致病因素[48- 49]。有学者对C19MC miRNA进行了Kaplan-Meier生存分析，发现miR- 512- 1、miR- 516a- 1和miR- 519a- 2水平与HCC患者的OS呈负相关；进一步的COX比例模型表明高表达的miR- 512- 1和miR- 516a- 1是影响HCC患者OS的独立危险因素，HR分别为1.521和1.662；ROC曲线也显示T分期联合3-miRNA比单纯T分期作为预后模型AUC值从0.728增加至0.76；并且这3种miRNA的启动子区域表现出一致的低甲基化，提示与HCC预后相关的C19MC miRNA受启动子区低甲基化调控而表达上调，从而有望成为HCC诊断和治疗的潜在靶标[50]。另外，DNA低甲基化诱导高水平的hsa-miR- 21- 5p与包括HCC在内的6种肿瘤患者较差的OS相关(HR>1)，其中，在HCC患者中的HR为1.6，表明miR- 21低甲基化在HCC患者预后不良中的重要价值[51]。然而，人们对于miR- 429在HCC中的作用产生了不同的看法。有研究表示miR- 429通过直接靶向PTEN/PI3K/AKT/β-catenin轴来促进HCC细胞迁移和侵袭，并认为其启动子区域的甲基化不足是操纵HCC细胞迁移和侵袭的初始因素[52]。与上文所述的miR- 429在HCC组织和细胞中表达下调的观点相反[39]，分析miR- 429可能在HCC发生发展的不同阶段表现不同的作用。

综上所述，不同的miRNA在肿瘤发生发展中可能承担不同的角色，即使同一种miRNA也可能在不同肿瘤或肿瘤发生的不同阶段发挥不同的作用。miRNA甲基化异常可能是影响肝癌发生发展的关键信号，有助于肝癌的早期筛查、诊断和疾病预后。然而，miRNA甲基化生物标志物仅限于实验室研究阶段，其特异性和敏感性尚待确认。因此，迫切需要找到更多有价值的甲基化生物标志物，以早期警示肝癌的发生和发展。

miRNA甲基化药物与HCC治疗

对于未发现远处转移且肝功能良好的HCC患者，当前临床实践指南建议手术切除。对于不可切除的HCC，多采用局部消融、肝动脉介入治疗、精准治疗、系统治疗和肝移植的综合疗法。作为HCC中重要的生物标志物，启动子DNA高甲基化可能被用作该疾病潜在脱甲基剂的靶标[53]。miRNA在肝癌中的作用已进行大量研究，这使得miRNA甲基化生物标志物成为可能的治疗靶标。由于大多改变miRNA甲基化状态来治疗HCC的临床研究尚少，以下将重点介绍3种用于HCC治疗的miRNA甲基化药物。

树突状纳米姜黄素姜黄素是一种从姜黄根茎中提取的联苯类化合物，具有抗炎、抗氧化和抗肿瘤的治疗特性[54]。已经确定姜黄素在诱导DNA甲基化中的巨大潜力，但是它的低生物利用度阻碍其临床应用，因此，树突状纳米姜黄素(dendrosomal nanocurcumin，DNC)在无任何不良反应的前提下，增加了姜黄素在癌细胞中的吸收，并可通过修饰失调的表观遗传机制来延缓HCC的进展，为进一步临床治疗奠定基础[55- 56]。

DNC通过沉默HepG2和Huh7细胞系中的DNMT1/3A/3B来恢复miR- 34s的表达，进而降低Huh7和HepG2细胞的生存能力[56]。另外，依赖DNC的miR- 29a和miR- 185的过表达可以下调DNMT1/3A/3B的表达，并随后通过DNA甲基化使HCC中MEG3的表达增加[57]。这些结果提示，DNC可以过表达miRNA来阻止肝癌进展。虽然研究中已报道DNMT表达下调，但并没有直接指出miRNA的甲基化状态，还需要更深入的研究将DNC与miRNA甲基化联系起来，以明确DNC在临床尤其是HCC治疗中的应用前景。

卡斯蒂霉素卡斯蒂霉素(casticin，CAS)是从葡萄果中提取的一种聚甲基黄酮，具有抗癌等多种药理活性。已经有研究表明，miR- 148a- 3p是一种抑制肿瘤的miRNA，可在包括HCC在内的多种肿瘤中表达沉默[58- 60]。并且miR- 148a- 3p与DNMT1之间的负向调控参与促进和维持HCC干性特征，而CAS则抑制DNMT1的活性，使miR- 148a- 3p去甲基化，通过使增强其表达，抑制HCC细胞干性特征[60]。因此，CAS可能是人类肝癌的一种辅助治疗剂，还需要更深入的临床研究进一步证实。

三氧化二砷三氧化二砷(arsenic trioxide，ATO)是一种古老的药物，已被描述为可用于治疗许多癌症，尤其是在急性早幼粒细胞白血病的治疗中，ATO可诱导线粒体介导的细胞凋亡[61- 63]。为了探索ATO在肝癌耐药性中的表观遗传调控，有研究发现，ATO通过诱导DNA去甲基化激活了miR- 148a，从而通过靶向p65来降低NF-κB的表达并抑制CSC的表型，使HCC细胞对5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil，5-FU)和奥沙利铂药物敏感[64]。这一发现揭示了ATO在增强HCC对化疗药物敏感的新机制，有望成为HCC治疗策略的潜在方法。

此外，还有研究报道，DNA甲基化调节的miR- 193a- 3p通过靶向抑制SRSF2表达来促使HCC对5-FU的耐药[65]。总的来说，在肝癌治疗期间，miRNA甲基化药物可以降低全基因组或特定miRNA的甲基化水平，从而抑制肝癌细胞的生长。通过针对DNMT的活性和DNA甲基化模式的改变，来探索miRNA在HCC治疗中的应用已成为一种新策略。

小结与展望

在过去的十多年里，技术的进步使miRNA甲基化领域发生了革命性的变化，并在HCC中发现了许多表观遗传失调的miRNA，这些miRNA由CpG岛超甲基化和低甲基化调控，所以miRNA基因的异常DNA甲基化可能在肝癌临床应用中发挥潜在的价值。本篇综述提供了全面的证据，证明miRNA甲基化与HCC的发生发展、诊断预后、治疗和耐药密切相关(图1)。然而，miRNA甲基化生物标志物尚未应用于临床，许多可能改变miRNA甲基化状态的药物正在临床试验中，对HCC的表观遗传诊断和治疗仍存在许多未来的挑战。因此，了解表观遗传变化与HCC的因果关系，揭示特定甲基酶在HCC治疗策略中的作用，对HCC相关的miRNA甲基化的详细机制进行更深入的研究，并利用最新的技术将基因组学与靶向表观遗传重编程和表观遗传因子的直接操作结合起来，可以增强人们对miRNA甲基化在HCC中全新认识，实现完全的临床应用。