丙戊酸钠抑制脯氨酰内肽酶活性对非酒精性脂肪性肝病进展的影响

李梦婷，蒋黛西，张建斌，魏建东，陈长喜，李红亮

1.宁波大学附属人民医院 消化内科，浙江 宁波 315000；2.上海交通大学医学院附属新华医院 消化内科，上海 200092；3.上海市宝山区中西医结合医院 急诊科，上海 201900

非酒精性脂肪性肝病（non-alcoholic fatty liver disease, NAFLD）在全球患病人数不断增加，非酒精性脂肪性肝炎（non-alcoholic steatohepatitis, NASH）是其严重类型[1]。脯氨酰内肽酶（prolyl endopeptidase, PREP）是一种能特异性水解神经活性肽、小肽类激素和多种细胞因子的丝氨酸蛋白酶，在肝脏中活性较高[2-3]。笔者前期体内体外实验均证实肝细胞脂肪变时伴PREP活性升高[2-4]，抑制PREP活性[2]或PREP表达缺失[5]均可抑制肝细胞脂肪变，提示抑制PREP对NAFLD进展可能有保护作用。丙戊酸及其钠盐是目前世界上最常用的抗癫痫药物，有研究称长期服用丙戊酸对人体肝功能有一定的损害作用[6]，但同时丙戊酸有显著的PREP活性抑制作用[7-8]，它对NAFLD进展的影响目前鲜见报道。本研究采用高脂高胆固醇饮食构建小鼠NAFLD模型，并用具有PREP活性抑制功能的丙戊酸钠进行干预，观察其对NAFLD进展的影响。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物：42 只雄性7～8 周龄，体质量18～20 g，无特殊病原体野生型C57BL/6J小鼠购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，生产许可证：SCXK（沪）2012-0002。

1.1.2 主要试剂：高脂高胆固醇饲料（10%猪油+2%胆固醇+88%基础饲料，总热卡4.8 kcal/g）购自南通特洛菲饲料科技有限公司；丙戊酸钠购自荷泽方明药业集团股份有限公司；底物Suc-Gly-Pro-AMC购自瑞士BaChem公司；7-氨基-4-甲基香豆素（7-amino-4-methylcoumarin, AMC）购自美国Sigma-Aldrich公司；苏木精-伊红（HE）试剂盒购自北京索莱宝生物科技有限公司；兔抗小鼠PREP抗体购自美国Abcam公司；其他抗体均购自上海碧云天生物科技研究所。RT-qPCR和TRIzol试剂盒均购自日本Takara公司。

1.2 方法

1.2.1 动物模型制备：用标准饲料适应性饲养小鼠1周后，将小鼠分为对照组（15只）、模型组（10只）和干预组（17只），对照组喂以普通饲料，模型组和干预组喂以高脂饲料，8周后干预组给予0.4%丙戊酸钠饮用水[9-10]，继续干预8周后，隔夜禁食，次日称量体质量，通过眼眶静脉取血，颈椎脱臼处死小鼠，解剖留取肝组织和血清，保存于-80 ℃冰箱。

1.2.2 血生化指标测定：采用全自动生化分析仪检测血清生化指标。

1.2.3 病理标本制备：取部分肝组织经4%多聚甲醛固定2 h后予石蜡包埋，制备切片，常规HE染色后置于光镜下观察肝组织形态。采用NAFLD活动度积分（NAFLD activity score, NAS）进行评分（0～8分），NAS≥5分可诊断NASH，NAS＜3分可排除NASH，处于两者之间为NASH可能[11]。

1.2.4 肝组织中PREP活性测定：取100 mg小鼠肝组织，加入浓度为10 mmol/L，pH 7.4 的Tris-HCl 500 μL后均匀裂解，在4 ℃ 16 000×g的离心机中离心20 min。取10 μL上清液，加入到465 μL上述浓度Tris-HCl中，放置于30 ℃水浴箱中恒温孵育30 min。后加入25 μL底物Suc-Gly-Pro-AMC（4 mmol/L），继续放置于30 ℃水浴箱中恒温反应60 min，用500 μL醋酸钠缓冲液（1 mol/L，pH 4.2）终止反应。取100 μL终末反应液加入至96孔板中，用BioTek Synergy H4检测终末反应液的荧光强度（激发波：360 nm，吸收波：460 nm）[12]。同时以AMC作为标准曲线，测定其荧光强度并计算终末反应液中AMC的浓度。用BCA法测定上清液中总蛋白浓度，各样本中PREP酶活性的高低以每毫克蛋白每分钟能水解产生的AMC量（pmol·min-1·mg-1）来表示。

1.2.5 肝组织中PREP mRNA测定：称取50 mg肝组织，采用TRIzol法进行RNA提取并测定各组RNA浓度及纯度，通过RT-qPCR法将mRNA反转录合成cDNA，利用cDNA进行荧光实时定量PCR扩增，设置3个复孔，以GAPDH为内参，计算PREP基因相对表达量，最终结果以RQ值（2-ΔΔCT）表示。各基因引物由上海生工生物工程股份有限公司合成，GAPDH上游引物5’-TGC ACCACCAACTGCTTAG-3’，下游引物5’-GGATGCAGGGATG ATGTTC-3’；PREP上游引物5’-GACCACTGATTACGGGTG CT-3’，下游引物5’-AGAAGCATGGACGGGTACTG-3’。

1.2.6 肝组织中PREP蛋白检测：提取肝组织内蛋白，采用BCA法测定各组蛋白浓度（BCA试剂购自上海碧云天生物科技研究所）。采用蛋白质印迹（Western blot）法对蛋白样本进行电泳，将分离开的蛋白转印至PVDF膜上，用脱脂牛奶封闭后加入一抗（兔抗小鼠PREP抗体，1:1 000），4 ℃孵育过夜，用1×TBST洗膜15 min×3次，加入辣根过氧化物酶标记的二抗孵育2 h，再用1×TBST洗膜15 min×3次，采用增强化学发光法显色。以β-Actin作为内参，用Image Lab软件分析条带灰度值，并计算目的蛋白的相对表达量。

1.3 统计学处理方法 采用SPSS23.0软件进行分析。计量资料以±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 小鼠体质量、肝指数和睾脂指数比较 模型组小鼠体质量、肝指数、睾脂指数与对照组相比均显著升高（P＜0.05）；干预组小鼠肝指数与模型组相比显著下降（P＜0.05）。见表1。

表1 3组小鼠体质量、肝指数和睾脂指数比较（±s）

表1 3组小鼠体质量、肝指数和睾脂指数比较（±s）

与对照组比：aP＜0.05；与模型组比：bP＜0.05

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2.2 小鼠血清生化指标的比较 除谷草转氨酶（AST）外，模型组小鼠血清总胆固醇（TC）、低密度脂蛋白（LDL）、甘油三酯（TG）、谷丙转氨酶（ALT）、碱性磷酸酶（ALP）、空腹血糖（FBG）、胰岛素等均显著高于对照组（P＜0.05）；干预组小鼠血清TC、TG、ALT较模型组显著下降（P＜0.05），LDL、AST、ALP、FBG、胰岛素等与模型组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

表2 3组小鼠血清生化指标比较（±s）

表2 3组小鼠血清生化指标比较（±s）

与对照组比：aP＜0.05；与模型组比：bP＜0.05

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2.3 小鼠肝组织形态及病理学改变和NAS比较

2.3.1 肝脏大体形态：在相同曝光条件下，用同一背景板作衬垫，观察解剖时小鼠在体肝脏外观形态。可见对照组小鼠肝脏呈暗红色，形态正常，质地较软，被膜光滑，边缘锐利，切面无油腻感；模型组小鼠肝脏呈现奶黄色，体积显著增大，边缘钝圆，被膜紧张，切面明显油腻感；干预组小鼠肝脏黄带暗红，体积较模型组略小，边缘稍钝，切缘稍油腻感。见图1。

图1 3组小鼠肝脏大体形态

2.3.2 肝脏HE染色：对照组小鼠具有完整的肝小叶结构，肝细胞内未见明显的脂滴沉积；模型组小鼠肝组织发生广泛大泡性脂肪变性，间质内炎症细胞明显浸润，门脉区可见坏死灶及炎症细胞聚集，同时易见气球样变性；干预组小鼠脂肪变性明显减轻，可见个别炎性细胞浸润，肝小叶和汇管区结构无明显改变。见图2。

图2 3组小鼠肝脏组织HE染色结果（×200）

2.3.3 各组小鼠肝脏NAS比较：与对照组相比，模型组小鼠肝脏出现明显的脂肪变性、炎症及气球样变（P＜0.05），经丙戊酸钠干预后，脂肪变性和炎症明显改善，NAS显著下降（P＜0.05），见表3。

表3 3组小鼠肝脏NAS比较

2.4 3组小鼠肝组织内PREP mRNA及其蛋白表达和活性水平比较 模型组肝组织PREP mRNA及PREP蛋白活性均高于对照组（P＜0.05）；干预组肝组织PREP mRNA与模型组比较差异无统计学意义（P＞0.05）；干预组PREP蛋白活性相比于模型组降低（P＜0.05）；3组之间肝组织PREP蛋白相对表达量差异无统计学意义（P＞0.05）。见图3。

图3 各组小鼠肝组织PREP表达及活性

3 讨论

NAFLD是以肝细胞脂肪变性和炎症改变为特征的临床病理综合征[13]。虽然目前已经认识到饮食、代谢、环境和遗传等多种综合因素共同导致的脂肪组织增生、胰岛素抵抗和肠道微生态紊乱等是NAFLD的发病基础[1，14]，但NAFLD特别是NASH的发病机制仍有待深入阐明。

丙戊酸钠是目前癫痫类疾病治疗的首选药物，有研究显示丙戊酸钠可造成微泡性脂肪性肝炎和肝硬化。那么，在NAFLD患病率不断增加的背景下，丙戊酸钠是否仍可以安全地使用于NAFLD人群目前仍缺乏相关研究证据。

丙戊酸钠具有显著的PREP抑制活性[8]。PREP是一种在体内广泛分布的丝氨酸蛋白酶，作为酶功能可特异性水解短肽链中脯氨酸残基羧基端肽键[2]。在肝脏中，库普弗细胞和肝细胞均可表达PREP蛋白，同时两者是肝损伤修复的关键细胞[17]。研究表明，PREP参与调节炎症反应和脂质积聚[2]，而肝内炎症微环境和脂肪变性正是促使NASH发生发展的两个基本要素[18]。已有研究显示，抑制PREP活性能减轻中性粒细胞性炎症，其机制可能与中性粒细胞趋化因子脯氨酰-甘氨酰-脯氨酸（proline-glycineproline, PGP）的生成减少有关[7]。PREP可与基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases, MMP）-8/9协同，水解胶原蛋白I/II产生三肽PGP[19]，PGP结合于中性粒细胞表面趋化性细胞因子CXC受体（CXC receptor, CXCR1和CXCR2），进而对中性粒细胞产生聚集效应[20]，抑制PREP或MMP活性及运用PGP拮抗剂均可显著抑制中性粒细胞性炎症。上述现象已在结肠炎[21]、动脉粥样硬化[22]、慢性阻塞性肺病[23]等炎症疾病中观察到。

肝内炎症微环境形成的原因是细胞免疫失衡，病理表现为多种炎症细胞浸润和激活[24]。肝内库普弗细胞是较早认识的促进NAFLD发生发展的关键效应细胞之一，在小鼠NAFLD模型中，通过TOLL样受体9 激活信号可刺激库普弗细胞产生IL-1β，进而导致肝细胞脂肪变、炎症和纤维化[25]。而近年来，中性粒细胞在NAFLD发生发展中的作用受到更为广泛的关注。例如中性粒细胞释放免疫调控蛋白LCN-2（Lipocalin-2）作用于巨噬细胞，促进其炎症反应，并分泌LCN-2诱导自身表达CXCR2，进而激活ERK1/2导致多种促炎细胞因子的产生，促进中性粒细胞与巨噬细胞肝内浸润，形成炎症级联放大反应[26]。我们团队在先前的研究结果中观察到PREP基因敲除小鼠肝组织中巨噬细胞和中性粒细胞聚集减少，众多炎症因子例如TNF-α、IL-6、IL-1β、LCN-2、CXCR2、ERK1/2表达显著下降，同时PREP基因敲除小鼠肝脏中MMP-8、MMP-9和PGP的产生均较野生型小鼠明显减少[5]。

本研究显示，NAFLD模型鼠给予丙戊酸钠处理后，脂肪变和炎症没有加重，反而得到一定程度改善，同时，肝内PREP活性也受到明显抑制。结合团队先前的研究结果，猜测丙戊酸钠改善NAFLD小鼠肝脏炎症可能与抑制PREP活性后MMP-8/9 和PGP产生减少有关，从而改善了中性粒细胞-巨噬细胞炎症瀑布反应，进一步验证上述炎症因子、MMP-8/9和PGP表达量有助于回答以上问题。

有研究发现，PREP蛋白/活性下调后，能够改善促进NAFLD/NASH发病的不良因素如肥胖[27]、糖代谢异常[28]等。此外，PREP活性与细胞脂质代谢密切相关。本团队在先前的体内体外实验中均发现肝细胞脂肪变时伴随PREP活性升高，抑制PREP活性或PREP基因敲除后成脂相关基因如脂肪酸合成酶、过氧化物酶体增生物激活受体-γ、胆固醇调控元件结合蛋白-1c、乙酰辅酶A羧化酶等表达量显著下调，肝细胞脂肪变性显著改善[2，5]，因此我们推测，丙戊酸钠改善NAFLD小鼠脂肪变性可能与调节脂质代谢相关基因有关，后续将进一步验证上述基因表达量。

虽然已有研究报道丙戊酸钠会导致胰岛素抵抗及肝脏脂肪变性，促进NAFLD进展[29]，但本研究展示了不同的结果，这可能与丙戊酸钠的剂量、作用方式、肝脏的微环境状态有关，有待进一步验证。

综上所述，丙戊酸钠在体内对肝脏的作用机制多样，NAFLD小鼠应用0.4%丙戊酸钠并未加重肝损伤，推测可能与NAFLD阶段体内微环境改变有关，NAFLD患者应用丙戊酸钠的安全性值得进一步研究。