木香内酯DSPE-PEG纳米胶束的制备、表征及对胶质瘤细胞凋亡的诱导作用

王成德，许允求，苏志鹏

温州医科大学附属第一医院 神经外科，浙江 温州 325015

神经胶质瘤是中枢神经系统中最常见的恶性肿瘤，占颅内肿瘤的60%左右，具有高发病率、低治愈率、高病死率等特点[1-3]。此外，胶质瘤还具有高侵袭性、高复发率的特点，传统的治疗手段有手术、放疗和化疗，但目前患者的平均生存时间仅14.6个月[4-5]。目前临床尚无有效治疗方法，患者5年生存率仍然低于5%[6]。木香内酯（micheliolide, MCL）是从缅桂花中分离得到的倍半萜内酯[7]。既往研究表明MCL可通过PI3K/Akt、NF-κB和MAPK等多种信号通道[7-9]在癌症治疗、炎症、免疫调节性急性骨髓性白血病和肾纤维化中均发挥作用。研究发现MCL对胶质瘤细胞生长也具有明显抑制作用[10]。但是，MCL在水溶液中溶解性较低，限制了它的临床应用[11]。目前，多种纳米材料被开发为药物载体，以封装药物分子，并靶向地将其递送到病变部位，以提高药物疗效，减少药物不良反应[12]。本研究将纳米材料DSPE-PEG作为药物载体携带MCL，研究其对U87和U251胶质瘤细胞的杀伤作用，为临床胶质瘤治疗提供参考。

1 材料和方法

1.1 主要仪器 旋转蒸发仪（N-1300V-WB，上海巴玖公司）；透射电子显微镜（TEM Tecnai F20，美国FEI公司）；加热磁力搅拌器（DF-101S，郑州佰泽仪器有限公司）；激光粒度分析仪（S3500，美国麦奇克有限公司）；高效液相色谱仪（Agilent 1100，美国安捷伦公司）；冷冻高速离心机（美国Thermo scientific公司）；酶标仪（美国Beckman公司）；荧光光学显微镜（日本Olympus公司）；倒置普通显微镜（日本Olympus公司）；SDS-PAGE电泳仪（美国Bio-rad公司）。

1.2 细胞和试剂 U87和U251 胶质瘤细胞均由温州医科大学附属第一医院中心实验室提供；MCL由南开大学药学院提供；DMEM培养基、胎牛血清、25%胰酶购自美国Gibco公司；Caspase3、Caspase8、Bcl-2购自美国Abcam公司；蛋白质印迹（Western blot）检测试剂盒、抗体稀释液、CCK-8试剂盒购自北京索莱宝公司。

1.3 方法

1.3.1 薄膜水化法制备MCL@DSPE-PEG：精密称取5 mg MCL、20 mg聚乳酸羟基乙酸共聚物（PLGA）、10 mg二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇（DSPE-PEG）和10 mg卵磷脂（lecithin）放入50 mL的圆底烧瓶中，加入氯仿10 mL振动摇匀至完全溶解。以一定的水浴温度及旋蒸速度减压旋蒸，挥干有机溶剂，使其在圆底烧瓶形成一层均匀薄膜，真空干燥20 min去除残留有机溶剂，再加入5%的葡萄糖溶液，用旋转蒸发仪旋转30 min，使形成的薄膜水化完全，将其转移至EP管中，冰水浴条件下探头超声10 min（功率65 W，超声2 s，间歇1 s），得MCL@DSPE-PEG脂质体混悬液；采用0.22 μm水膜过滤3次，得MCL@DSPE-PEG液体（取得的MCL@DSPE-PEG药液于4 ℃冰箱避光保存）。

1.3.2 MCL@DSPE-PEG纳米胶束的表征：取100 μL MCL@DSPE-PEG液体，用去离子水稀释10 倍，使用纳米粒度-电位分析仪测量MCL@DSPE-PEG的粒径和聚合物分散性指数（polymer dispersity index,PDI）。取制备好的MCL@DSPE-PEG经适当稀释，滴在TEM碳网上并干燥处理，用1%的磷钨酸溶液负染5 min使对比度增强，晾干后，样品用电镜观察拍照。

1.3.3 MCL@DSPE-PEG纳米胶束的稳定性测定：将制备好的MCL@DSPE-PEG放入4 ℃冰箱避光保存，并分别于制备的0、2、4、6、8和12 d观察有无沉淀析出并检测粒径大小变化。

1.3.4 MCL@DSPE-PEG纳米胶束的载药量和包封率：精密量取MCL@DSPE-PEG冻干粉适量，记为B0；加入1 mL去离子水溶解，用甲醇稀释5倍；涡旋5 min使脂质体结构完全破坏，经0.22 μm油膜过滤；HPLC检测并收集数据，计算1 mL去离子水中含MCL药物的总质量，记为B1。载药量计算公式：载药量（%）=B1/B0×100%。

精密量取过滤前及过滤后的MCL@DSPE-PEG液体200 μL，用甲醇稀释5倍；涡旋5 min使脂质体结构完全破坏，经0.22 μm油膜过滤；HPLC检测收集数据，经计算：过膜前药物质量为A0，过膜后药物质量为A1。包封率计算公式：包封率（%）=A1/A0× 100%。

1.3.5 MCL@DSPE-PEG纳米胶束的体外释放：精密量取制备好的MCL@DSPE-PEG液体1 mL，置入预先处理过的透析袋中，扎紧袋子两端后以40 mL的等渗PBS缓冲液浸泡。维持100 r/min和37 ℃恒温，持续震荡。按设定时间间隔置换等体积介质（取出释放介质0.5 mL，补充新鲜介质0.5 mL）。将上述取出的释放介质累积后在10 000 r/min条件下离心10 min，取上清液。上述步骤完成后，将透析袋内液体全部置入释放介质内，混匀取样。将取出的样品加入HPLC检测并计算出每个时间点累计释放药物量及总药物量，绘制药物释放曲线。

1.3.6 MCL@DSPE-PEG纳米胶束的体外抗肿瘤实验

1.3.6.1 细胞培养：U87和U251 胶质瘤细胞系用含有10%胎牛血清的DMEM培养基，置于37 ℃、5% CO2、饱和湿度条件下传代培养。

1.3.6.2 DSPE-PEG毒性检测：将对数生长期的U87和U251胶质瘤细胞接种于96孔板，先培养24 h，然后在96孔板中加入DSPE-PEG，加入量分为10、20、40 μL 3个梯度，并按5个复孔设置。24 h后吸除培养液，每孔加入10 μL CCK-8溶液。培养箱中孵育2 h，酶标仪测定450 nm处的吸光度。其中40 μL浓度梯度组分别在0、1、2 d时间点用酶标仪检测450 nm处的吸光度。

1.3.6.3 细胞克隆形成：将各组细胞接种于12孔板，接种密度为300/皿，培养10 d。培养皿内出现肉眼可见的菌落即终止培养。最后以4%多聚甲醛固定10 min，染色，随机选取5个视野，显微镜下拍照。1.3.6.4 Western blot检测：预先处理好U87和U251 胶质瘤细胞，分别加入裂解液，在冰上裂解20 min，4 ℃、10 000 r/min离心20 min收集上清液。BCA法测定蛋白浓度后计算加样量，行10% SDSPAGE电泳并转膜，抗体孵育后使用ECL显影。

1.4 统计学处理方法 采用SPSS22.0进行数据分析，计量资料采用±s表示，2组间比较采用独立样本t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 液体外观 本研究合成的MCL@DSPE-PEG纳米胶束液体外观呈乳白色半透明溶液（见图1）。

图1 MCL@DSPE-PEG纳米胶束溶液外观

2.2 透射电镜图像 本研究制得的MCL@DSPE-PEG纳米胶束在透射电镜下可见其外观为规整的球形，大小稍有差异，分散度较好。DSPE-PEG纳米胶束的粒径为（105.1±0.5）nm，PDI为0.244±0.002；载药后MCL@DSPE-PEG纳米胶束的粒径为（123.8± 0.5）nm，PDI为0.236±0.005。见图2。

图2 纳米胶束的粒径分布和透射电镜图像

2.3 纳米胶束的稳定性 MCL@DSPE-PEG纳米胶束在4 ℃下放置2周的稳定性良好（见图3）。

图3 MCL@DSPE-PEG纳米胶束的稳定性

2.4 载药量与包封率 MCL@DSPE-PEG纳米胶束的包封率为85.49%±3.66%，载药量为8.96%±0.56%。

2.5 体外释放曲线 MCL@DSPE-PEG纳米胶束在体外有明显的缓慢释放现象，长时间的累积释放度为73.3%，很好地达到了体外缓慢释放MCL的效果（见图4）。

图4 MCL@DSPE-PEG纳米胶束药物释放曲线

2.6 体外抗肿瘤效果 U87和U251胶质瘤细胞正常条件下呈对数生长（见图5A）。加入10 μL、20 μL DSPE-PEG后，U87和U251细胞生长不受影响；加入40 μL DSPE-PEG后，U87和U251细胞生长变慢，但仍继续增殖（见图5B）。加入MCL@DSPE-PEG后，加入的浓度越高，对U87和U251胶质瘤细胞生长抑制越强；加入的MCL@DSPE-PEG作用时间越长，对U87和U251胶质瘤细胞生长抑制也越强（见图5C）。加入5 μL MCL@DSPE-PEG后，U87 的克隆形成率为12.33%；U251的克隆形成率为10.33%（见图6）。

图5 胶质瘤细胞在不同条件下生长情况

图6 MCL@DSPE-PEG对U251、U87细胞克隆形成的影响

2.7 对诱导细胞凋亡的作用 与模型组比，加入MCL@DSPE-PEG后，U87和U251胶质瘤细胞中Bcl-2蛋白表达水平降低，Caspase3、Caspase8蛋白表达水平升高，差异均有统计学意义（P＜0.05），见图7。

图7 MCL@DSPE-PEG对U251、U87细胞内凋亡相关蛋白表达的影响

3 讨论

本研究以DSPE-PEG纳米脂质体为载体，通过薄膜水化法采用溶液中自组装的形式将难溶于水的MCL包埋在脂质体内核中。借助纳米载体极大提高了MCL的水溶性。表征结果显示MCL@DSPE-PEG纳米胶束具有粒径小、包封率及载药量高等优点。体外释放结果表明，MCL@DSPE-PEG纳米胶束与普通的MCL相比，药物释放慢，很好地达到了体外缓慢释放的效果，并且浓度上升稳定，显示出纳米胶束在体外可长时间稳定作用的潜力。体外细胞毒性实验进一步证实，MCL@DSPE-PEG纳米胶束能抑制U87和U251胶质瘤细胞生长。

中药由于其长期的临床应用历史而受到越来越a多的关注。因中药具有的低毒和治疗潜力被应用在各种类型疾病的治疗，包括多种类型的癌症，例如肺癌、乳腺癌和神经胶质瘤[13-14]。MCL是从缅桂花中分离得到的倍半萜内酯，已被发现具有多种生理和药理特性，例如抗炎和通过各种信号通路的抗癌活性[8-9]。但MCL的稳定性和溶解度低，限制了其药效的发挥。因此，通过纳米递药系统解决MCL的上述问题具有重要的临床意义，尤其在治疗脑肿瘤方面，纳米颗粒由于能更好地穿透血脑屏障，在靶组织中具有更高的浓度，因此比传统单药方法更具优势。

脂质体DSPE-PEG作为药物递送系统被用于亲脂性药物的递送；其具备的水溶性、生物相容性和无免疫原性等优势突出[15]，这些特性可以减弱肝脾网状内皮系统等体内免疫系统的特异性识别功能[16-17]，从而延长在体内的存留时间；此外，其大分子尺寸结构，不易被肾小球滤过，故能延长药物在体内的作用时间[17-20]。DSPE-PEG内核具有良好的亲脂性，MCL是难溶于水的亲脂性药物，有一定的疏水性，能结合在DSPE-PEG亲脂性内核中。为了使纳米粒子达到最佳的肿瘤摄取效率，具有高效的肿瘤渗透能力，能通过EPR效应有效地实现肿瘤部位的药物累积，需要严格控制纳米粒的粒径。对于脑肿瘤还面临需要通过血脑屏障的问题。研究发现，在直径200 nm以下的粒子可以比较容易地通过血脑屏障[21]。我们合成的MCL@DSPE-PEG颗粒直径在123.8nm左右，理论上能够很好地满足对血脑屏障透过性的要求，需要在后期的实验中进一步验证。本研究中MCL@DSPE-PEG载药量为8.96%±0.56%，在其他研究中，大多数纳米材料的负载能力都在10%以下[22-23]。由于MCL与DSPE-PEG纳米胶束的亲脂性内核紧密结合在一起，在体内循环过程中不易短时间解离释放，减少了药物到达作用位点前的损失。另外，本研究中合成的纳米颗粒具有较高载药率，在体外表现出明显的缓慢释放现象，大大延长药物作用时间及作用效果。纳米递药颗粒具备与缓释类药品相似的优点，可显著降低血药浓度峰谷波动，减少给药次数，从而缓解患者的治疗痛苦，在临床中具有极高的应用价值。

在既往研究中发现MCL可能通过下调NF-κB/COX-2 信号通路抑制神经胶质瘤的生长[24]。本研究进一步从机制上探讨了MCL通过凋亡信号通路对胶质瘤细胞的生长抑制作用。Caspase家族在细胞凋亡发生过程中起重要作用。根据目前研究显示，凋亡起始因子Caspase8（还包括Caspase9、Caspase10和Caspase12）与促凋亡信号紧密结合。该起始因子激活之后，可激活下游Caspase-3蛋白，促使DNA修复酶失活，从而诱发细胞凋亡[25-26]。线粒体信号通路也参与了细胞凋亡的调控，Bcl-2家族是线粒体信号通路重要成员[27]。提取MCL@DSPEPEG干预后的U87 和U251 细胞蛋白，进行Western blot实验表明，MCL@DSPE-PEG纳米胶束能通过抑制胶质瘤细胞中Bcl-2蛋白表达，影响胶质瘤细胞内线粒体功能，还能促进细胞内Caspase8、Caspase3 蛋白表达上升来促使细胞内DNA修复酶失活，进而诱发细胞凋亡，从而抑制胶质瘤细胞生长。

综上所述，MCL@DSPE-PEG纳米胶束具有粒径小、载药量高、缓慢释药等优点；MCL@DSPE-PEG纳米胶束能通过抑制胶质瘤细胞中Bcl-2 蛋白表达，影响胶质瘤细胞内线粒体功能，还能促进细胞内Caspase8、Caspase3蛋白表达水平升高来诱导细胞凋亡，从而抑制胶质瘤细胞生长。