黄芪-莪术诱导宫颈癌细胞凋亡的靶网络识别及配伍机制探讨

孙浩，郑涌泉，徐梦瑾

浙江大学医学院附属妇产科医院 药剂科，浙江 杭州 310006

目前，在世界范围内宫颈癌是第四大常见的女性癌症，是严重威胁女性健康的恶性肿瘤。中医认为宫颈癌属崩漏、带下、癥瘕等范畴，其主要病因是脏腑气血失调、冲任受损，治疗当以活血化瘀，补气扶正为主[1]。黄芪、莪术配伍起到补气化瘀的作用，这与宫颈癌患者机体的病证是相对应的。尽管目前黄芪、莪术的有效成分被不断发现，但鲜有从整体角度研究黄芪-莪术的配伍机制。黄芪、莪术的多种有效成分及其整体协同的作用特点是治疗宫颈癌的优势所在。因此，本研究旨在通过生物信息学、GO聚类和k-核分解等方法识别黄芪-莪术诱导宫颈癌细胞凋亡的靶网络，同时通过K-means聚类、分子对接和TOPSIS法确定潜在有效成分和关键靶点，通过CCK-8法、TUNEL染色、流式细胞术以及Western blot等方法探讨其诱导凋亡的作用及整体配伍机制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 实验细胞：宫颈癌SiHa细胞由浙江大学医学院提供，培养于含10%胎牛血清的DMEM培养基中，置于37 ℃、含5%的CO2加湿恒温培养箱中培养，并每周传代2次。

1.1.2 药物与试剂：黄芪、莪术中药材购自杭州华东中药饮片有限公司。DMEM培养液、胎牛血清和0.25%胰蛋白酶-EDTA购自美国Gibco公司。细胞培养瓶、6孔板、12孔板、96孔板和巴斯德吸管购自美国Corning公司。PBS购自杭州诺森德生物技术有限公司。CCK-8试剂盒、细胞周期与细胞凋亡检测试剂盒、PMSF、BCA蛋白检测试剂盒、RIPA裂解缓冲液和TBST购自合肥白鲨生物科技有限公司。TUNEL试剂盒、DAPI染色液购自上海碧云天生物技术有限公司。p53、β-catenin和GAPDH小鼠单克隆抗体购自武汉赛维尔生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 宫颈癌疾病背景网络的构建：从Disgent（https://www.disgenet.org/）、OMIM（https://omim.org/）、KEGG（https://www.kegg.jp/）、TTD（http://db.idrblab.net/ttd/）和RGD（https://rgd.mcw.edu/）等数据库收集宫颈癌相关蛋白。将这些蛋白映射到String（https://string-db.org/）数据库构建宫颈癌疾病生物总网络。通过Metascape（https://metascape.org/）对这些蛋白进行GO富集分析，每一条被富集的GO生物过程即为一个生物子网络，这些生物子网络之间相互连接构成了宫颈癌疾病背景网络。所有网络通过Cytoscape软件进行可视化。

1.2.2 K-means聚类确定潜在关键靶点：通过对总网络进行网络分析，确定网络中每一个节点的属性。选取节点度和介数中心值两个节点属性进行K-means聚类分析。由于将宫颈癌相关蛋白分为潜在关键靶点和其他靶点两类，因此设置中心点个数k=2；由于数据量相对较小，而迭代次数越多越好，因此设置最大迭代次数为100。通过SPSS22.0统计软件进行分析，选取高节点度和高介数中心值的节点作为潜在关键靶点。

1.2.3 k-核分解确定靶网络：将每一个生物子网络进行k-核分解以获取最大Ks核图。Ks核可以定义为在图G=(V, E)中，其中V={v1, v2, …, vN}是所有节点的集合，N是节点总数，E={e1, e2, …, eM}是所有边的集合，M是边的总数。若存在子图Gk={(Vk, Ek),Vk⊆V, Ek⊆E}，对每个节点v∈Vk，v的节点度大于或等于k，则子图Gk是图G的Ks核。通过递归的方法去除所有节点度小于k的节点及其连边，直到不能分解的最大Ks核子网络，从而得到每个节点度都大于等于k的最大Ks核图。最大Ks核图中潜在关键靶点构成的网络便是靶网络。见图1。

图1 k-核分解示意图

1.2.4 分子对接评估潜在关键靶点：通过TCMSP（https://tcmspw.com/）化合物数据库收集黄芪、莪术的活性成分。将这些活性成分与靶网络中的潜在关键靶点使用AutoDock Vina软件进行分子对接。将这些潜在关键靶点与各自对应的已知抑制剂或激活剂进行分子对接，统计每一个靶点作用的广泛性和有效性。广泛性定义为能与该靶点结合的化合物数目，表示为对接得分小于-5 kcal/moL的化合物数。有效性定义为与该靶点结合能力比已知配体更好的化合物数目，表示与对接得分小于已知抑制剂或激活剂的化合物数。靶点有效性对应的化合物定义为该靶点的潜在有效成分。

1.2.5 TOPSIS法评估潜在关键靶点：TOPSIS法是多目标决策分析中一种常用的有效方法。由于潜在关键靶点的广泛性和有效性都是正向的指标，所以通过公式进行标准化处理。随后，确定每一个指标的最大值Z+和最小值Z-。再确定每一个评价对象与最大值的接近程度和最小值的接近程度最后，根据最终评价指标确定最佳潜在关键靶点。Ci越接近于1表明该靶点的广泛性和有效性越好。

1.2.6 中药水提液制备：根据中国药典和临床使用经验，选用黄芪、莪术药物用量比例为3:1。将药物浸泡0.5 h，加10倍量的纯水回流提取3次，每次0.5 h。进行旋转蒸发浓缩药液并定容至药液浓度为1 000 mg/mL。1 000 r/min离心5 min后，0.22μm微孔滤膜滤过，4 ℃保存。

1.2.7 细胞活力测定：使用CCK-8法测定SiHa细胞的活力，将SiHa细胞以5×103个细胞/孔的密度接种到96孔板的对照和实验组中。于24 h后，将实验组的培养基更换为含有不同浓度中药提取液的新鲜培养基，设置浓度梯度为6.25、12.5、25、50、100、200 mg/mL，对照组和空白组更换为无药的新鲜培养基。分别干预24、48 h后，每孔加入10 μL CCK-8溶液孵育1.5 h，在450 nm波长处测定光密度（OD）值，并计算细胞活力及IC50。细胞活力（%）=（实验组OD值-空白组OD值）/（对照组OD值-空白组OD值）×100%。每组至少设置6个复孔。

1.2.8 TUNEL染色：SiHa细胞以1×105个细胞/孔的密度接种在12孔板上。24 h后设置对照组与实验组，对照组为无药培养基，实验组为浓度为IC50的黄芪-莪术水提液。分别孵育24 h和48 h后，根据说明使用TUNEL试剂盒。将细胞用PBS洗涤，加入蛋白酶K工作溶液，浸入封闭缓冲液中，固定、冲洗并用0.1% Triton X-100浸润，然后对凋亡DNA片段进行FITC末端标记。细胞核用DAPI复染。在荧光显微镜下观察FITC标记的TUNEL阳性细胞，在至少6个视野内对TUNEL阳性细胞进行拍照。采用ImageJ软件计算细胞凋亡率，并进行统计分析。凋亡率（%）=凋亡细胞数/总细胞数×100%。

1.2.9 流式细胞术检测细胞凋亡：SiHa细胞以5× 105个细胞/孔的密度接种在6孔板上。24 h后，设置对照组与实验组，对照组为无药培养基，实验组为浓度为IC50的黄芪-莪术水提液。处理48 h后，用不含EDTA的胰酶消化后，用预冷的PBS洗涤细胞2次，4 ℃离心5 min收集细胞。加入100 μL 1×Binding Buffer重悬细胞，加入5 μL Annexin V-FITC和10 μL PI Staining Solution。轻轻混匀后，避光、常温反应10 min。最后，加入400 μL 1×Binding Buffer，混匀后上机检测。

1.2.10 流式细胞术检测细胞周期：SiHa细胞以1×105个细胞/孔的密度接种在6孔板上。处理48 h后，胰酶消化细胞，离心5 min沉淀细胞，用1 mL预冷的PBS洗细胞1次，再离心收集。细胞沉淀用1 mL预冷的70%乙醇混匀，4 ℃固定过夜。离心5 min沉淀细胞，加入0.5 mL碘化丙啶染色液，37 ℃避光孵育30 min后上机检测。

1.2.11 Western blot分析：将SiHa细胞以5×105个细胞/孔的密度接种在6孔板中。处理48 h后，用预冷的PBS轻轻洗涤细胞两次，分别加入PMSF、蛋白酶抑制剂和蛋白裂解液，冰上裂解15 min，4 ℃，离心30 min，提取总蛋白。采用BCA法进行蛋白定量，各泳道上30 μg蛋白进行SDS-PAGE凝胶电泳后转移至PVDF膜，5%脱脂奶粉室温（37 ℃）封闭1 h。随后，加入一抗（1:1 000稀释），4 ℃孵育过夜，TBST洗膜3次，10 min/次，加入相应的二抗（1:5 000稀释），室温摇床孵育1 h，TBST洗膜3次。ECL增强化学发光试剂显色成像。采用ImageJ软件对条带进行量化。

1.3 统计学处理方法 采用SPSS22.0统计软件分析。计量资料以±s表示，2组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 宫颈癌疾病总网络和潜在关键靶点 通过多个疾病数据库删除重复后共收集了979个宫颈癌相关蛋白，其中Disgent数据库有964个，RGD数据库22个，KEGG数据库7个，TTD数据库7个，OMIM数据库1个。这些相关蛋白相互作用构成了宫颈癌疾病生物总网络，见图2A。删除孤立节点和重复的边后，网络中共625个节点和3 553条边。K-means聚类分析显示，有73个宫颈癌相关蛋白具有高介数中心值和高节点度的特点，是潜在的关键靶点。所有节点的介数中心值与度的二分类见图2B。

图2 宫颈癌疾病生物总网络和潜在关键靶点的二分类图

2.2 宫颈癌背景网络及GO聚类 将宫颈癌疾病生物总网络进行GO聚类分析。取前20 个GO生物过程聚类重新构建网络，获得宫颈癌背景网络图，见图3A。其中，前20个GO生物过程聚类的富集气泡，见图3B。富集分析结果显示，排在第一位的GO生物过程是细胞死亡的正调控。在该GO聚类下，富集的子集分别是程序性细胞死亡的正调控、凋亡过程的正调控、凋亡信号通路的正调控、内源性凋亡信号通路的正调控。提示凋亡过程是宫颈癌疾病研究的一个重要过程。

图3 宫颈癌背景网络和GO生物过程聚类的富集分析

2.3 宫颈癌凋亡相关的靶网络 凋亡相关的子网络（即细胞死亡正调控的聚类）共富集了145个宫颈癌相关蛋白，在去除孤立节点后共107个节点和345条边，见图4A。对该网络的k-核分解显示，最大Ks为6，最大Ks核图由26个节点和103条边构成。在该最大Ks核图中有14个潜在关键靶点通过41条边紧密连接构成了凋亡相关靶网络。

2.4 潜在关键靶点的综合评估 通过成分数据库共收集了87个黄芪活性成分和81个莪术活性成分。去除重复后，共166个成分与靶网络中的14个潜在关键靶点进行分子对接。靶点广泛性前三个靶点为SRC（154）、TP53（133）和SIRT1（123），靶点有效性前三个靶点为TP53（84）、CTNNB1（56）和CASP8（46）。通过广泛性和有效性两个指标对14个潜在关键靶点进行TOPSIS综合评价，最高的前三个靶点分别为TP53（0.93）、CTNNB1（0.69）和CASP8（0.60），见表1。靶点有效性对应的化合物即为潜在有效成分，这些潜在有效成分与潜在关键靶点的作用关系见图4B；提示64个黄芪潜在有效成分和44个莪术潜在有效成分协同作用于14个潜在关键靶点，同时绝大多数黄芪的成分（60个）作用于TP53，绝大多数莪术的成分（38个）作用于CTNNB1。

表1 靶网络中潜在关键靶点分子对接与TOPSIS结果

图4 凋亡相关子网络的k-核分解和靶网络潜在关键靶点与潜在有效成分的作用

2.5 黄芪-莪术水提液对SiHa细胞的细胞活力影响与对照组比，24 h和48 h的各浓度黄芪-莪术水提液的细胞存活率均显著降低，差异有统计学意义（P＜0.05），见图5A和图5B。黄芪-莪术水提液在24 h和48 h的IC50分别为62.47 mg/mL和50.37 mg/mL，见图5C。黄芪-莪术水提液对宫颈癌SiHa细胞生长具有显著的抑制作用，并呈现一定的浓度依赖性。

图5 黄芪-莪术（3:1）水提液对宫颈癌SiHa细胞活力的影响

2.6 黄芪-莪术水提液对SiHa细胞早期凋亡影响 SiHa细胞用浓度为50.37 mg/mL的黄芪-莪术（3:1）提取液分别处理24 h和48 h后，均可见明显的TUNEL荧光，见图6A和6B。与对照组比，24 h和48 h的细胞凋亡率明显上升，差异有统计学意义（P＜0.05）；48 h与24 h相比，细胞凋亡率也明显上升，差异有统计学意义（P＜0.05），见图6C。SiHa细胞用黄芪-莪术水提液处理后发生明显凋亡，且48 h比24 h的凋亡更为明显。

图6 黄芪-莪术（3:1）水提液处理宫颈癌SiHa细胞24 h和48 h后的荧光染色结果（×100）

细胞凋亡的流式细胞术结果显示，与对照组比，实验组的早期凋亡率和总凋亡率明显提高，差异具有统计学意义（P＜0.05），而晚期凋亡率差异无统计学意义（P＞0.05），见图7。黄芪-莪术水提液主要诱导宫颈癌SiHa细胞发生早期凋亡。

图7 黄芪-莪术（3:1）水提液对宫颈癌SiHa细胞细胞凋亡的影响

2.7 黄芪-莪术水提液诱导SiHa细胞G0/G1期阻滞 细胞周期的流式细胞术结果显示，与对照组比，实验组的G0/G1期细胞明显增加，S期细胞明显减少，差异有统计学意义（P＜0.05），见图8。黄芪-莪术水提液能诱导宫颈癌SiHa细胞在G0/G1期阻滞。

图8 黄芪-莪术（3:1）水提液对宫颈癌SiHa细胞细胞周期的影响

2.8 黄芪-莪术水提液对p53 和β-catenin蛋白表达的影响 黄芪-莪术水提液处理48 h后，p53 和β-catenin的表达Western bolt条带图，见图9A。与对照组比，实验组的p53相对表达量明显提高，差异有统计学意义（P＜0.05），见图9B。与对照组比，实验组的β-catenin的表达水平变化不明显，差异无统计学意义（P＞0.05），见图9C。黄芪-莪术水提液能显著提高宫颈癌SiHa细胞的p53表达水平。

图9 黄芪-莪术水提液对p53和β-catenin蛋白表达的影响

3 讨论

临床上黄芪、莪术是一组常用药对，从古至今广泛应用于妇科癥瘕积聚等疾病。张锡纯《医学衷中参西录·治女科方》中提到理冲汤，方中黄芪、党参配三棱、莪术以消一切脏腑癥瘕、积聚[2]。国医大师朱良春认为癌瘕积聚这类病症应选益气活血、化瘀生新之品，方能奏养正消积之功。他指出：“黄芪得莪术则使黄芪补而不滞，莪术得黄芪则助莪术破血化瘀之力以消癥瘕。两药相伍，使行中有补，补中有行，共奏补气化瘀之功[3]。”黄芪作为一个补中益气的常用中药，含有多糖类、皂苷类、黄酮类以及氨基酸等多种有效成分，具有免疫刺激、抗肿瘤、抗病毒、抗炎和抗氧化等多种药理活性[4-5]。莪术为破血行气的代表中药，含有挥发油、姜黄素类、多糖类及生物碱类等多种有效成分，具有抗肿瘤、抗血栓、抗氧化等多种药理活性[6-7]。现代药理学研究表明，黄芪作为天然的免疫调节剂，其多种有效成分通过增强机体的免疫机制而发挥抗肿瘤作用：黄芪多糖能够提高免疫器官指数、促进免疫细胞的成熟、刺激细胞因子的释放、影响免疫球蛋白的分泌和调节免疫信号的传导，从而增强机体免疫功能[8]；黄芪甲苷IV能够通过抑制调节性T细胞频率以增强机体免疫反应，通过诱导细胞毒性T淋巴细胞激活以发挥体内抗癌活性[9]。莪术则作为抗

肿瘤常用中药，其抗癌有效成分也不断地被报道：姜黄素会扰乱线粒体膜电位的平衡而增强对Bcl-xL蛋白的抑制，同时上调死亡受体DR 4和DR 5的表达来促进癌细胞的凋亡[10]；β-榄香烯通过减弱癌细胞中Wnt/β-catenin信号通路而发挥治疗作用[11]。因此，配伍使用黄芪、莪术防治宫颈癌的潜力巨大。

本研究通过生物信息学的手段收集了宫颈癌疾病相关蛋白并构建了对应的背景网络。在对宫颈癌背景网络进行GO富集分析后，本课题组发现排在第一位的GO生物过程是细胞死亡的正调控。在该GO聚类下，富集的子集分别是程序性细胞死亡的正调控、凋亡过程的正调控、凋亡信号通路的正调控、内源性凋亡信号通路的正调控。可见，凋亡是宫颈癌疾病研究的一个重要过程，这与本研究TUNEL染色和流式细胞凋亡的结果是一致的。随后，继续对该凋亡相关的子网络进行深入分析，以获取凋亡相关的靶网络。然而，靶网络的获取过程很有可能是一个复杂网络研究的过程，正如之前提到的，对于复杂疾病不能只专注于特定的疾病靶点，也无法关注所有的扰动。因此，更应该关注于复杂疾病网络的核心，通过引入社会科学研究中常用的k-核分解这一方法，从而确定疾病网络中的核心部分[12]。然而，考虑到生物网络和社会网络的差异性，如果直接进行k-核分解，可能许多重要的靶点被忽略，甚至获得的核心网络会毫无意义。生物网络更倾向于不同生物过程的聚类，不同聚类之间连接的节点往往承载了许多的生物信息流。因此，在进行k-核分解之前通过构建背景网络提前对整个疾病涉及的生物过程进行聚类，以防止确定的靶网络单一化；通过K-means聚类分析确定潜在关键靶点，以防止确定的靶网络忽略了重要的靶点。之后，通过分子对接和TOPSIS法综合评估了凋亡相关靶网络中的潜在关键靶点并确定了潜在的有效成分。发现64个黄芪潜在有效成分和44个莪术潜在有效成分协同作用于14个潜在关键靶点构成的靶网络从而发挥诱导凋亡的作用。同时绝大多数黄芪的成分（60个）作用于TP53，绝大多数莪术的成分（38个）作用于CTNNB1。因此，最后通过Western blot检测了TP53和CTNNB1两个基因的蛋白表达水平。

TP53基因是一种抑癌基因，其编码的蛋白p53介导的细胞信号转导途径在调节细胞正常生命活动中起着重要的作用[13]。当DNA受损时，p53会诱导p21的表达，从而导致细胞周期停滞在G1期，以允许DNA修复[14-15]。如果细胞不能修复DNA损伤，p53通过激活BAX、PUMA、Noxa和PERP等凋亡信号基因诱导细胞凋亡[16]。Western blot结果显示，黄芪-莪术水提液能明显提高p53蛋白的表达水平。同时，流式细胞周期结果也表明，黄芪-莪术处理后有更多的细胞阻滞在G0/G1期。因此，猜测作用于p53蛋白的60个黄芪潜在有效成分能协同拯救p53突变功能，促使p53介导的信号转导恢复正常。CTNNB1基因编码的蛋白β-catenin是一种黏着连接蛋白，通过调控细胞生长以及细胞间的黏附，对上皮细胞层的构建与维持起着重要作用[17]。细胞核中的β-catenin则是TCF/β-catenin转录的开关，调控着靶基因的转录[18]。凋亡抑制因子Survivin是Wnt/β-catenin信号下游靶基因的一员，能间接抑制效应caspase 3活性[19]，从而抑制细胞凋亡。然而，Western blot结果显示，β-catenin的表达水平变化不明显。猜测38个莪术潜在有效成分或许并不影响β-catenin的整体表达水平，但能通过某种方式抑制其在细胞核中的累积，发挥诱导凋亡的作用。

综上所述，黄芪-莪术可能通过其多个有效成分协同调控以p53为主的靶网络，使细胞周期阻滞在G0/G1期，从而发挥诱导宫颈癌细胞早期凋亡的作用。