草苁蓉多糖调控miR-138-5p对H2O2诱导H9c2心肌细胞凋亡和氧化损伤的影响

刘 青

氧化应激在心肌缺血再灌注损伤、动脉粥样硬化、心力衰竭、糖尿病性心肌病等多种心血管疾病的发病机制中发挥着重要作用[1]。氧化应激导致活性氧过量产生，过量的活性氧破坏机体氧化-抗氧化平衡系统，对心肌细胞造成损伤；氧化应激增强导致线粒体功能障碍，激活心脏凋亡信号通路，进一步加重心肌损伤[2]。因此，减轻心肌细胞氧化应激和/或直接抑制凋亡可能是一种有效的心脏保护策略。草苁蓉多糖是我国传统中药草苁蓉的活性成分，具有抗氧化、抗肿瘤、免疫增强、保肝等作用[3]。相关研究证实，草苁蓉多糖通过抗凋亡、抗氧化应激作用可缓解四氯化碳所致肝损伤和过氧化氢所致内皮细胞损伤[4-5]。关于草苁蓉多糖对心肌细胞保护作用的研究报道较少。微小RNA(miRNA)定义为长度约20 nt的非编码RNA，通过直接结合mRNA的3′非翻译区(3′UTR)抑制翻译或降解mRNA，参与调控细胞存活、细胞凋亡等生物过程。有研究显示，miR-138-5p在不稳定型心绞痛中下调，过表达miR-138-5p可提高缺氧复氧心肌细胞活力，抑制细胞凋亡[6]。然而，miR-138-5p在心肌细胞氧化损伤中的作用尚未完全明确。本研究以H2O2诱导H9c2心肌细胞建立氧化损伤模型[7]，探讨草苁蓉多糖对H2O2所致心肌细胞凋亡、氧化应激损伤的影响，并以miR-138-5p为切入点探讨其保护作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料 大鼠H9c2心肌细胞(中国典型培养物保藏中心)；DMEM/F12培养基、青链霉素双抗、胎牛血清(武汉普诺赛生物公司)；细胞计数试剂盒8(CCK-8)、miRNA反转录试剂盒、miRNA荧光定量检测试剂盒(北京百奥莱博生物公司)；膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素(Annexin V-FITC)/碘化丙啶(PI)凋亡检测试剂盒、5×蛋白上样缓冲液、化学发光试剂(上海碧云天生物公司)；兔源白细胞淋巴瘤(Bcl)-2、磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)、Bcl相关X蛋白(Bax)抗体，羊抗兔IgG二抗(美国Abcam公司)；超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒、乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒、丙二醛(MDA)试剂盒(北京索莱宝生物科技公司)。

1.2 方法 每组设置3个复孔，实验重复3次，

1.2.1 细胞培养和实验分组 H9c2心肌细胞复苏后，接种到含有10%胎牛血清、1%青链霉素双抗的DMEM/F12培养基，置于37 ℃、含5%CO2培养箱进行培养。胰酶消化90%融合H9c2心肌细胞，按照1∶4比例传代培养。将对数期H9c2心肌细胞以1×105个/孔接种到6孔板，利用LipofectamineTM2000分别转染miR-NC、miR-138-5p mimics、anti-miR-138-5p至60%融合H9c2心肌细胞，转染6 h后，将无血清培养液更换为含10%胎牛血清DMEM/F12培养液。收集转染48 h后进行后续实验。

实验分组，con组：正常培养的H9c2心肌细胞；H2O2组：使用含50μmol/L H2O2的培养液孵育细胞2 h[7]；H2O2+草苁蓉多糖-低剂量(L)组、H2O2+草苁蓉多糖-中剂量(M)组、H2O2+草苁蓉多糖-高剂量(H)组：使用含0.05 mg/mL、0.10 mg/mL、0.50 mg/mL草苁蓉多糖[8]培养24 h后，50 μmol/L H2O2孵育2 h；H2O2+miR-NC组、H2O2+miR-138-5p组、H2O2+anti-miR-138-5p组：使用含50 μmol/L H2O2培养液孵育转染miR-NC、转染miR-138-5p mimics、转染anti-miR-138-5p的细胞2 h；H2O2+草苁蓉多糖+anti-miR-138-5p组：使用含0.05 mg/mL、0.1 mg/mL、0.5 mg/mL草苁蓉多糖培养转染anti-miR-138-5p细胞24 h后，50 μmol/L H2O2孵育2 h。

1.2.2 CCK-8法检测细胞活力 取2×103个转染H9c2心肌细胞或未转染细胞接种在96孔板中，按照1.2.1分组进行给药和/或H2O2处理。将10 μL的CCK-8溶液添加到每个孔中，之后在37 ℃条件下孵育2 h，酶标仪读取450 nm处的光密度(OD)表示细胞活力。

1.2.3 流式细胞术检测细胞凋亡 使用1×结合缓冲液重悬各组H9c2心肌细胞使细胞浓度约为1×106个/mL。向500 μL细胞悬液中加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI，黑暗环境中染色20 min。流式细胞仪收集荧光信号，FlowJo 8.7.1软件分析细胞凋亡率。

1.2.4 蛋白免疫印迹法检测Bax和Bcl-2蛋白表达 全蛋白提取试剂盒分离H9c2心肌细胞总蛋白。按照4∶1体积将蛋白样品与蛋白上样缓冲液(5×)混合，100 ℃加热5 min，充分变性蛋白。取30 μg冷却蛋白加入到十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)胶加样孔内，设置电压100 V，时间90 min。利用标准湿式转膜装置进行转膜，设定转膜电流为300 mA，时间60 min。向洗膜盒中预先加入漂洗液，转膜结束后立即将膜漂洗1～2 min，滴管吸尽漂洗液。使用5%牛血清蛋白4 ℃封闭过夜。滴管吸尽封闭液，立即用稀释的一抗溶液室温封闭2 h。洗涤液洗涤5～10 min。共洗涤3次。滴管吸尽洗涤液，立即加入稀释好的二抗室温孵育1 h。采用化学发光试剂显色，GAPDH作为内参，化学发光成像仪检测目的蛋白表达量。

1.2.5 试剂盒检测MDA水平、SOD活性及LDH释放量 分别收集各组H9c2心肌细胞培养液上清、细胞沉淀至新的离心管中。按照LDH检测试剂盒说明测定细胞培养液上清液LDH释放量。向细胞沉淀中加入提取液，超声破碎细胞，收集上清液，按照商品试剂盒说明书检测MDA水平及SOD活性。

1.2.6 实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)检测miR-138-5p表达 Trizol试剂分离各组H9c2心肌细胞总RNA，采用miRNA反转录试剂盒合成cDNA，再用miRNA荧光定量检测试剂盒进行RT-qPCR。2-△△Ct法分析miR-138-5p表达量。miR-138-5p正向引物为5′-AGCTGGTGTTGTGAATCAGGCCG-3′，反向引物为5′-TGGTGTCGCGTGGAGTCG-3′；U6正向引物为5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′，反向引物为5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′。

2 结 果

2.1 草苁蓉多糖对H2O2诱导H9c2损伤的影响 与con组比较，H2O2组H9c2细胞活力、Bcl-2蛋白表达、miR-138-5p表达降低(P<0.05)，凋亡率、Bax蛋白表达升高(P<0.05)；与H2O2组比较，H2O2+草苁蓉多糖-L组、H2O2+草苁蓉多糖-M组、H2O2+草苁蓉多糖-H组H9c2细胞活力、Bcl-2蛋白表达、miR-138-5p表达升高(P<0.05)，凋亡率、Bax蛋白表达降低(P<0.05)；H2O2+草苁蓉多糖-L组、H2O2+草苁蓉多糖-M组、H2O2+草苁蓉多糖-H组细胞活力、凋亡率、Bcl-2和Bax蛋白表达、miR-138-5p表达比较，差异均有统计学意义(P<0.05)。详见图1、表1。

图1 草苁蓉多糖对H2O2诱导H9c2心肌细胞凋亡及Bax、Bcl-2蛋白表达的影响(A为各组细胞凋亡率；B为Bax、Bcl-2蛋白条带图。1为con组；2为H2O2组；3为H2O2+草苁蓉多糖-L组；4为H2O2+草苁蓉多糖-M组；5为H2O2+草苁蓉多糖-H组)

2.2 草苁蓉多糖对H2O2诱导H9c2氧化应激的影响 与con组比较，H2O2组H9c2心肌细胞SOD活力降低(P<0.05)，LDH释放量、MDA水平升高(P<0.05)；与H2O2组比较，H2O2+草苁蓉多糖-L组、H2O2+草苁蓉多糖-M组、H2O2+草苁蓉多糖-H组H9c2心肌细胞SOD活力升高(P<0.05)，LDH释放量、MDA水平降低(P<0.05)；H2O2+草苁蓉多糖-L组、H2O2+草苁蓉多糖-M组、H2O2+草苁蓉多糖-H组细胞SOD活力、LDH释放量、MDA水平比较，差异均有统计学意义(P<0.05)。详见表2。

2.3 miR-138-5p对H2O2诱导H9c2心肌细胞损伤氧化应激的影响 与H2O2组、H2O2+miR-NC组比较，H2O2+miR-138-5p组H9c2心肌细胞miR-138-5p表达、细胞活力、SOD活性、Bcl-2蛋白升高，凋亡率、Bax蛋白表达、LDH释放量、MDA水平降低(P<0.05)。详见图2、表3。

图2 miR-138-5p对H2O2诱导H9c2凋亡及Bax、Bcl-2蛋白表达的影响(A为各组H9c2心肌细胞凋亡率；B为Bax、Bcl-2蛋白条带图。1为H2O2组；2为H2O2+miR-NC组；3为H2O2+miR-138-5p组)

2.4 抑制miR-138-5p对草苁蓉多糖处理的H2O2诱导H9c2心肌细胞损伤的影响 与H2O2组比较，H2O2+草苁蓉多糖组H9c2心肌细胞miR-138-5p表达，细胞活力、Bcl-2蛋白表达升高(P<0.05)，凋亡率、Bax蛋白表达降低(P<0.05)；与H2O2组比较，H2O2+anti-miR-138-5p组H9c2心肌细胞miR-138-5p表达、细胞活力、Bcl-2蛋白表达降低(P<0.05)，凋亡率、Bax蛋白表达升高(P<0.05)；与H2O2+草苁蓉多糖组比较，H2O2+草苁蓉多糖+anti-miR-138-5p组H9c2心肌细胞miR-138-5p表达、细胞活力、Bcl-2蛋白表达降低(P<0.05)，凋亡率、Bax蛋白表达升高(P<0.05)。详见图3、表4。

图3 抑制miR-138-5p逆转草苁蓉多糖对H2O2诱导H9c2心肌细胞凋亡及Bax、Bcl-2蛋白表达的影响(A为各组细胞凋亡率；B为Bax、Bcl-2蛋白表达条带图。1为H2O2组；2为H2O2+草苁蓉多糖组；3为H2O2+anti-miR-138-5p组；4为H2O2+草苁蓉多糖+anti-miR-138-5p组)

2.5 抑制miR-138-5p对草苁蓉多糖处理的H2O2诱导H9c2心肌细胞氧化应激的影响 与H2O2组比较，H2O2+草苁蓉多糖组H9c2心肌细胞SOD活性升高(P<0.05)，LDH释放量、MDA水平降低(P<0.05)；与H2O2组比较，H2O2+anti-miR-138-5p组H9c2心肌细胞SOD活性降低(P<0.05)，LDH释放量、MDA水平升高(P<0.05)；与H2O2+草苁蓉多糖组比较，H2O2+草苁蓉多糖+anti-miR-138-5p组H9c2心肌细胞SOD活性降低(P<0.05)，LDH释放量、MDA水平升高(P<0.05)。详见表5。

组别LDH(U/L)MDA(nmol/L)SOD(U/mL)H2O2组8 722.29±270.2768.05±6.1826.02±1.50H2O2+草苁蓉多糖组3 132.12±158.85①17.57±1.59①99.02±8.30①H2O2+anti-miR-138-5p组12 512.84±345.82①98.33±6.49①9.53±0.66①H2O2+草苁蓉多糖+anti-miR-138-5p组7 186.32±215.22②51.20±3.43②36.90±3.70②F值2 052.881432.007645.129P<0.001<0.001<0.001

3 讨 论

正常生理条件下，心肌细胞活性氧的产生和清除处于平衡状态，缺血、高血糖引起的活性氧生成增加导致氧化应激和心肌细胞损伤。草苁蓉多糖的抗氧化作用已被广泛报道，Quan等[9]研究表明，草苁蓉多糖通过核转录因子(NF)-κB信号通路增强抗氧化防御系统，抑制炎症反应，减少凋亡信号通路，从而减轻半乳糖胺/脂多糖诱导的肝损伤。刘莉园等[10]研究显示，草苁蓉多糖可能调控Jun激酶(JNK)、p38及NF-κB途径，从而预防氧化损伤所致血管内皮细胞凋亡。本研究探讨草苁蓉多糖对H2O2所致心肌细胞损伤的保护作用。生理状态下LDH无法穿透细胞膜，当细胞膜损伤时LDH可释放到细胞外基质，通过检测LDH水平可直接反映细胞膜完整性[11]。本研究结果显示，草苁蓉多糖以浓度依赖方式抑制H2O2诱导的LDH释放和细胞凋亡，提高H9c2细胞活力，上调抗凋亡蛋白Bcl-2表达水平，下调促凋亡蛋白Bax表达水平，表明草苁蓉多糖可减轻H2O2诱导的细胞损伤。活性氧与脂质、蛋白质等生物大分子相互作用，诱导细胞毒性和功能障碍。SOD等细胞抗氧化酶可降低细胞内活性氧，抑制脂质过氧化反应[12]。本研究中应用草苁蓉多糖处理，降低了MDA生成，提高SOD活性，表明草苁蓉多糖可减轻H2O2诱导的细胞氧化应激损伤。

miR-138-5p已证实在脊髓损伤、急性肺损伤、脑缺血再灌注损伤、心肌缺氧复氧损伤中发挥着重要作用[13-14]。Li等[15]以大脑中动脉闭塞大鼠模型模拟脑缺血再灌注损伤发现，miR-138-5p表达下调，过表达miR-138-5p可抑制炎症，改善神经功能。Hu等[16]研究显示，急性心肌梗死大鼠和缺氧复氧诱导的心肌细胞miR-138-5p表达下调，过表达miR-138-5p可抑制缺氧复氧诱导的细胞凋亡和炎症反应。Chang等[17]研究表明，右美托咪通过上调miR-138-3p减轻改善心肌缺血再灌注损伤小鼠的心室重构。本研究中H2O2诱导后H9c2心肌细胞中miR-138-3p表达降低，草苁蓉多糖以浓度依赖方式增加miR-138-3p表达量，提示草苁蓉多糖可能与调控miR-138-3p表达有关。转染miR-138-3p mimics进行功能实验，结果表明过表达miR-138-3p可抑制H2O2诱导的H9c2心肌细胞凋亡、LDH释放，抑制MDA生成，下调Bax蛋白表达，上调Bcl-2蛋白表达，提高细胞活力和SOD活性，与草苁蓉多糖的保护作用机制一致；转染的anti-miR-138-3p抑制miR-138-3p表达加剧H2O2诱导的H9c2心肌细胞凋亡和氧化损伤。抑制miR-138-3p可减弱草苁蓉多糖对H2O2诱导的H9c2心肌细胞凋亡和氧化损伤的影响，表明草苁蓉多糖通过上调miR-138-3p对H2O2诱导的心肌细胞凋亡和氧化应激损伤发挥保护功能。

本研究不足之处在于，miR-138-3p反向靶基因、草苁蓉多糖是否调控其他miRNA发挥保护功能有待进一步确认。综上所述，草苁蓉多糖通过上调miR-138-3p表达可减轻H2O2诱导的心肌细胞凋亡和氧化应激损伤，为草苁蓉多糖防治与氧化应激相关的心血管疾病提供了理论基础。