基于网络药理学探讨桃红四物汤促进骨折愈合的主要活性成分及作用机制

乔 宇，袁发浒，卯玉嵘，王 昕，胡 骏，赵志刚*，

（1.江汉大学 医学院，湖北 武汉 430056；2.武汉市第四医院 脊柱外科，湖北 武汉 430033）

骨折是临床中常见多发病，可导致机体局部肿胀、疼痛、畸形、活动受限等症状。据统计，我国50岁以上人群总骨折患病率为26.6%。其中男性占比24.6%，女性达28.5%（P＜0.01）；其中髋部骨折患病率为1.9%，前臂骨折患病率为4.0%，脊椎骨折患病率为13.3%。并且中老年人骨折患病率随着年龄增长而增加，呈现女性高于男性，城市高于农村的趋势［1］。针对2018年9月至2019年8月北京协和医院骨科233例骨质疏松性骨折费用进行统计学分析，得出其平均住院天数为（6.6±7.9）d，平均住院费用为（64 890±38 250）元［2］。由于人们对生活质量的要求不断提高以及对住院费用问题的关注，如何快速促进骨折愈合成为了临床工作的重点。中医药为我国传统医学瑰宝，其中不乏大量治疗方法，中医治疗骨折讲究动静结合、筋骨并重、内外兼治的原则［3］，其中内外兼治则指骨折早期活血祛瘀、消肿止痛，骨折中期舒筋活络、接骨续筋，骨折后期补肝肾、强筋骨。

“桃红四物汤”首次见于吴谦所著的《医宗金鉴·妇科心法要诀》，为活血化瘀之代表药方，因此被广泛用于骨折治疗中［4］。“桃红四物汤”中熟地黄、白芍为血药，川芎、当归为气药，再加之桃仁、红花具有活血作用，全方具有养血而不滞血、活血而不伤血的疗效［5］。目前药理学认为“桃红四物汤”具有消炎、镇痛、扩张血管以及抑制肉芽肿形成，可促进骨痂区成骨细胞生成［6-7］。但其作用机制并未完全明确，因此采用网络药理学这一将生物信息学与药理学相结合的新兴学科来建立中药有效成分与疾病靶点之间的相互联系，为“桃红四物汤”治疗骨折提供更多依据，也为后期的深入研究提供研究思路。

1 材料与方法

1.1 “桃红四物汤”活性成分及对应靶点筛选

在中药系统药理数据库与分析平台（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP）中输入“桃红四物汤”主要成分（桃仁、红花、熟地黄、白芍、川芎、当归）的拉丁文，检索有效活性成分，由于中药成分较为复杂，并非所有成分均能被人体有效吸收、利用。口服生物利用度（oral bioavailability，OB）是决定药物是否能被人体吸收进入体循环并作用于靶点的重要指标。药物类似度（drug-likeness，DL）可评估药物化学成分的药代动力学特性。因此设定口服生物利用度（OB）≥30%［8］和类药性（DL）≥0.18［9］，最终得到有效活性成分及其所对应的有效作用靶点。

1.2 FH相关靶点查询

以“fracture healing”为检索词在GeneCards数据库（https：∥www.genecards.org/）进行检索，获得FH相关靶点，将查询结果以csv格式保存并导出。

1.3 构建药物-化合物-疾病共同靶点网络

为方便展示“桃红四物汤”在促进骨折愈合中的作用机制，将“桃红四物汤”有效作用靶点与“fracture healing”相关靶点两者取交集，构建韦恩图，图片以PNG格式导出。将共同靶点导入Cytoscape 3.8.2软件，绘制“药物活性成分-靶点-疾病”网络调控图，并通过设置不同的模式等，提高网络调控图中靶点相互作用可视化效果。

1.4 构建靶点间相互作用网络及核心靶点筛选

运用String 11.5（https：∥www.string-db.org/）中“multiple proteins”模式，将药物与疾病交集靶点导入，对其蛋白间相互作用（protein-protein interaction，PPI）进行分析，隐藏游离靶点，其他参数值保持默认，构建出PPI网络模型。导出PPI网络图和string_interactions.tsv文件。将所得文件导入Cytoscape 3.8.2，运用插件CytoNCA进行拓扑分析，首先通过限定计算度中心度（degree centrality，DC）筛选出TOP＞50%的靶点；再按中间度中心度（betweenness centrality，BC）筛选出TOP＞50%的靶点，最终得出PPI网络中的核心靶点。

1.5 交集靶点富集分析

不同的蛋白可能在生物学活动中发挥着协调效应，因此可以通过基因本体（gene ontology，GO）功能富集分析挖掘靶点蛋白在基因功能中的作用，利用京都基因与基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes andgenomes，KEGG）通路富集分析可预测“桃红四物汤”在促进骨折愈合中的核心通路。运用R语言包clusterProfiler对“桃红四物汤”与骨折愈合的共同靶点进行GO功能注释和KEGG通路富集分析。

1.6 构建KEGG关系网络

KEGG关系网络的构建可直观反映出各靶点参与通路的数目，以及不同通路中参与靶点的数目。利用Cytoscape 3.8.2构建KEGG关系网络，通过设定邻接节点数目（Degree）来分析关系网络图中的各靶点，设置为连续性变量，靶点的Degree值越大，在网络中的图形大小越大。各节点图形的大小反映了各靶点所参与的通路数目以及各通路中所参与的靶点数，图形越大，则节点的邻接节点数越多，更能直观反映出该节点在此网络中的重要程度，同时也反映出其生物学意义。

2 结果

2.1 “桃红四物汤”活性成分及有效靶点

利用TCMSP数据库并设定OB≥30%、DL≥0.18的筛选条件进行检索，最终得到化合物共69个（桃仁含有23个、红花含有22个、白芍含有13个、川芎含有7个、当归含有2个、熟地黄含有2个）。同时将得到的69个化合物所对应的有效靶点进行ID转换，再去除重复靶点，最终得到共计212个有效靶点。

2.2 “桃红四物汤”促进骨折愈合作用靶点预测

利用Gene Cards数据库对“fracture healing”进行检索，可得到相关靶点2 383个，再将促进骨折愈合的相关靶点与“桃红四物汤”的有效靶点进行取交集，最终得到140个共同靶点，见图1。

图1“桃红四物汤”与骨折愈合靶点韦恩图Fig.1 Venn diagram of common targets of THSWT and fracture healing

2.3 “药物活性成分-靶点-疾病”网络调控图

通过Cytoscape 3.8.2构建药物有效成分与骨折愈合靶点的网络调控图，该网络药理图总共包含180个节点（40个化合物节点、140个靶点节点）和373条关联线（图2）。其中交集靶点为绿色，白芍、川芎、红花、桃仁的活性成分为蓝色、橙色、黄色、粉色、药物共有的活性成分为红色。筛选出Degree值较大的节点进行后续分析，这些节点可能在调控中起到枢纽作用。其中PTGS2、NCOA2、PTGS1、HSP90AA1、PGR为Degree值排名前五的靶点，它们的Degree值分别是30、21、16、14、14。槲皮素（MOL000098）、木樨草素（MOL000006）、山柰酚（MOL000422）、黄芩素（MOL002714）、β-胡萝卜素（MOL002773）为Degree值排名前五的活性成分，它们的值分别为100、45、38、24、20。

图2“桃红四物汤”有效成分与骨折愈合靶点网络图Fig.2 Interaction network between ingredients in THSWT and fracture healing-related genes

2.4 蛋白互作网络构建分析及核心靶点筛选

将取交集得出的“桃红四物汤”可促进骨折愈合的140个交集靶点上传至String 11.5数据库，进行蛋白互作网络的构建，隐藏游离靶点最终得到包含140个靶蛋白节点，共2 653条相互作用线的PPI网络模型，见图3。同时保存string_interactions.tsv文件，并将其导入Ctyoscape 3.8.2软件，利用CytoNCA插件进行拓扑分析，见图4a；通过设置计算度中心度（DC）筛选TOP≥50%后创建子网络，见图4b；再通过设置中间度中心度（BC）≥50%后创建子网络，见图4c。同时运用count.R将string_interactions.tsv文件进行分析，最终得到PPI网络中度值最大的前30个交集靶点，其中排名前五的有ALB、AKT1、IL-6、VEGFA、CASP3，它们与其他蛋白相互作用，在该网络中起着关键作用，见图5。

图3 “桃红四物汤”促进骨折愈合靶点蛋白PPI网络图Fig.3 PPI network between ingredients in THSWT and fracture healing-related genes

图4 PPI网络拓扑分析核心基因Fig.4 PPI network topology analysis of core genes

图5 “桃红四物汤”促进骨折愈合关键蛋白直方图Fig.5 Histogram of THSWT promoting fracture healing key protein

2.5 GO功能富集分析

通过R语言对“桃红四物汤”促进骨折愈合靶点进行GO功能富集分析，并按照P＜0.05为筛选条件运行，最终获得GO条目2 258项，其中生物过程（biological process，BP）2 037项、细胞组成（cellular component，CC）71项、分子功能（molecular function，MF）150项。BP涉及富集基因较多 的 有response to oxidative stress、response to extracellular stimulus、cellular response to chemical stress等；CC涉及富集基因较多的有membrane raft、membrane microdomain、vesicle lumen等；MF涉及富集基因较多的有DNA-binding transcription factor binding、RNA polymerase II-specific DNA-binding transcription factor binding、ubiquitin-like protein ligase binding等；柱状图的长度和红色程度可反应富集基因的数目及显著程度。各类GO条目前20条注释，见图6至图8。

图6 GO富集分析（生物过程）Fig.6 GO Term(BP)

图7 GO富集分析（细胞组成）Fig.7 GO Term(CC)

图8 GO富集分析（分子功能）Fig.8 GO Term(MF)

2.6 KEGG信号通路富集分析及关系网络构建

利用R语言包clusterProfiler并以P＜0.05为筛选条件，对交集靶点蛋白进行KEGG富集分析，富集分析得到KEGG信号通路151条，将富集分析得出的前20项通路进行可视化，得到KEGG通路气泡图，见图9。从图中可见主要与骨折愈合有关的富集通路为AGE-RAG信号通路、IL-17信号通路、TNF信号通路、PI3K-Akt信号通路、Th17信号通路等。最后利用Cytoscape 3.8.2软件进行靶点-信号通路网络图的构建，得到包含20条信号通路和97个靶点蛋白的通路网络，见图10。绿色代表靶点蛋白，红色代表信号通路，将图形的长、宽按照Degree值，设置为连续性变量，此时网络中节点的Degree值越高，所对应的图形越大。因此，可以较为直观地通过网络中节点大小来判断其节点在该关系网络中的重要性。

图9 “桃红四物汤”促进骨折愈合有效成分KEGG富集Fig.9 KEGG terms of ingredients in THSWT related to fracture healing

图10 治疗靶点-信号通路网络Fig.10 Therapeutic target-signaling pathway network

3 讨论

骨折愈合分为三个阶段，分别是血肿机化期、骨痂形成期和骨痂塑性期，中医则认为骨折愈合的过程分为瘀去、新生、骨合［10］。“桃红四物汤”是中医药活血化瘀中最常见的复方之一，以桃仁、红花为主，四物汤为辅，可活血化瘀，消肿止痛，补益正气以生血。目前认为骨代谢、骨折断端周围血供以及炎性细胞等是影响骨折愈合重要因素［11］。近年来，各项临床研究均表明“桃红四物汤”对调节骨代谢，治疗骨折均起到促进作用，大鼠实验模型发现“桃红四物汤”可促使pSmad2磷酸化水平上调，进一步激活转化生长因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）信号通路，并加速骨折局部微血管血流速度，从而促进骨折愈合，并且有效延长疼痛反射弧，提高痛阈值［12-13］。

“桃红四物汤”中的槲皮素、木樨草素、山柰酚、黄芩素、β-胡萝卜素可能是促进骨折愈合的主要成分。通过核心靶点预测，可知“桃红四物汤”促进骨折愈合主要涉及ALB、AKT1、VEGF、CASP3、MMP3、MMP9、Jun、Fos、MYC、MAPK1、MAPK8、MAAPK14、EGF、EGFR等 核 心靶点。

MAPK1、MAPK8、MAPK14均为MAPK基因家族中的成员，在其MAPK通路中起着关键作用。MAPK8又称c—Jun氨基末端激酶（C—Jun N—terminal kinase，JNK），在JNK受到细胞外刺激时，JNK上游的MKK4、MKK7通过双磷酸化JNK的苏氨酸和酪氨酸位点而激活JNK，进而通过使c—jun激活区域的丝氨酸—63和丝氨酸—73位点双磷酸化而提高其转录活性，同时c—jun是AP-1复合体的一部分，在包括细胞增殖、分化和肿瘤转化等过程中起重要作用。有证据表明，在高压氧的刺激条件下，可通过调节PKC/JNK通路，促进骨折部位招募骨细胞，进而促进骨细胞增殖［14］。MAPK14又称p38丝裂原活化蛋白激酶（p38），MAPK1又称细胞外信号调节激酶（ERK2），通过实验发现添加p38、ERK2抑制剂后，小鼠胚胎成骨细胞前体细胞（MC3T3-E1）增殖作用明显减弱［15］，JNK、p38、ERK2可通过MAPK通路中的不同分支起到促进骨细胞增殖，进而促进骨折愈合的作用。EGF可作用于EGFR，促进EGFR信息通路，在许多研究中均证实EGFR是骨代谢的重要调节器，可通过调节成骨细胞的凋亡与增殖来控制成骨细胞数量，以及通过增加间充质干细胞（MSCs）数量来刺激骨骼形成，由此可反应EGFR在骨折愈合中起到不可或缺的作用［16］。

GO富集分析结果显示，“桃红四物汤”参与调节、促进骨折愈合的主要涉及response to oxidative stress、response to extracellular stimulus、cellular response to chemical stress、response to drug、response to nutrient levels等。KEGG富集分析示，“桃红四物汤”促进骨折愈合主要涉及PI3KAkt信号通路、AGE-RAGE信号通路、IL-17信号通路、TNF信号通路等。PI3K-Akt信号通路作为细胞内主要的信号转导途径之一，在细胞分化、代谢、炎症以及癌症中均发挥着重要作用。PI3K参与细胞生长以及细胞骨架重塑，同时具有抗凋亡调节作用［17］。它可被上游信号如EGFR，引起二聚体构象改变而被激活，活化的PI3K可改变Akt的蛋白结构，磷酸化可使其激活或抑制其下游底物，如CASP3、CASP9、NF-κB、mTOR等，从而参与细胞凋亡或代谢过程。动物实验也证明通过添加外源性Apelin-13，大鼠骨痂组织中PI3K p85、p-Akt蛋白表达水平增加，使得大鼠股骨骨密度、组织矿物质密度、骨体积分数、骨痂直径等均增加，从而促进大鼠股骨骨折愈合［18］。AGE-RAGE信号通路可激活下游通路，同时活化IL-6、NF-κB信号通路、半胱天冬蛋白酶3、基质金属蛋白酶等的表达，促进炎症因子的表达导致炎症反应［19-20］。IL-17已被确定为骨折修复期间骨再生的重要调节器，可作用于软骨细胞、骨细胞、内皮细胞等，并可诱导其他炎症因子如TNF-α，IL-1β，IL-6，GM-CSF等的表达，从而发挥其致炎作用。在小鼠研究中发现，IL-17F和IL-17Ra/c作为直接配体受体相互作用，依赖Wnt通路和β-Cateni信号激活骨细胞生成［21-22］。有研究［23］表明通过诱导Wnt/β-Catenin信号通路激活，使β-Catenin转移进入细胞核内，启动下游成骨基因转录，如c-myc可促进大鼠骨细胞的分化及骨移植物的矿化。通过抑制Wnt/β-Catenin信号通路，可使c-myc蛋白表达水平大大降低，进而抑制成纤维细胞的生存能力、矿化和骨质化［24］。TNF信号通路与炎症介导有关，研究［25-26］表明TNF-α的释放可改善大鼠髋部骨折处的骨体积分数与骨表面积/体积比，并且在骨折部位注射TNF-α可以提高软骨细胞分化进而改善骨折修复，这一修复过程可能与AMPK信号有关。因此，可以预测“桃红四物汤”促进骨折愈合可能更多与炎症反应以及细胞凋亡的调控密切相关。

综上所述，“桃红四物汤”治疗骨折具有多靶点、多途径、多通路的特点。影响骨折愈合的因素纷繁复杂，网络药理学的分析从分子层面进一步预测了“桃红四物汤”治疗骨折的分子作用机制，为后续临床规范诊疗提供了一些思路。但由于靶点众多、通路相互交错等因素以及网络药理学的自身局限性，研究结果可能存在偏差，有待进一步的实验论证。