齐墩果酸通过Nrf2抑制铁死亡并减轻重症急性胰腺炎大鼠肝损伤*

李 建，常东鸽，霍刘斌，程晓丹，潘晓立，吴慧丽

（郑州大学附属郑州中心医院1急诊科，2消化内科，河南郑州 450001）

急性胰腺炎是一种临床常见胰腺炎性疾病，伴随腹痛和血清淀粉酶（amylase，AMY）浓度升高，一般预后良好，然而少数可能发展为重症急性胰腺炎（severe acute pancreatitis，SAP），易引起多器官损伤，导致死亡［1］。肝损伤是SAP常见器官损伤之一，且肝衰竭是导致死亡的重要因素［2］，目前仍缺乏有效防治措施，因此分析SAP 肝损伤的机制可能有利于寻找治疗策略。

SAP 发生时，机体炎症和氧化应激反应爆发，攻击各组织器官，引起细胞凋亡、坏死，造成器官结构和功能损伤［3］。铁死亡为2012 年发现的细胞死亡的形式，依赖脂质过氧化和铁积累［4］。研究证明，铁死亡参与非酒精性脂肪性肝损伤［5］、缺血再灌注肺损伤［6］、SAP 肾损伤［7］等病理过程，通过抑制铁死亡可减轻上述损伤。核因子E2 相关因子2（nuclear factor E2-related factor 2，Nrf2）抗氧化轴为调节细胞抗氧化、死亡和存活的重要通路，激活Nrf2 通路可改善SAP 肝或肾损伤［8-9］。另外，Nrf2 活化后可通过影响谷胱甘肽过氧化物酶4（glutathione peroxidase 4，GPX4）等表达调节铁死亡过程，实现对非酒精性肝损伤［5］和缺血再灌注肺损伤［6］等的治疗。然而铁死亡在SAP肝损伤中的作用尚不清楚。

齐墩果酸（oleanolic acid，OLA）是提取自木犀科植物的天然萜类化合物，具有抗氧化、抗病原物、抗炎、抗糖尿病及保肝等作用，已被用作保肝药物多年［10］。在胆汁淤积急性肝损伤大鼠中的研究表明，OLA 可促进肝脏对胆酸的代谢能力，减轻肝损伤［11］。本实验拟建立SAP 大鼠模型，探讨铁死亡与SAP 大鼠肝损伤的关系，并分析OLA 对SAP 大鼠肝损伤过程中铁死亡和Nrf2-抗铁死亡轴的影响。

材料和方法

1 动物

40 只雄性8 周龄SD 大鼠，SPF 级，体重（300±10）g，购自北京维通利华公司，许可证号：SCXK（京）-2016-0011。均饲养于（24±1）℃、50%±5%湿度、12 h光/暗循环的动物房中，保持水和食物充足。

2 主要试剂和仪器

OLA 购自西安力邦制药公司；铁死亡抑制剂ferrostatin-1（FER1）和Nrf2 抑制剂brusatol（BRU）购自MCE；总胆汁酸（total bile acid，TBA）、丙氨酸转氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、天冬氨酸转氨酶（aspartate aminotransferase，AST）、白蛋白（albumin，ALB）及AMY试剂盒购自安图生物工程有限公司；总蛋白提取试剂盒、核蛋白提取试剂盒、HE 试剂盒及丙二醛（malondialdehyde，MDA）比色试剂盒购自上海生工生物公司；DCFH-DA 活性氧（reactive oxygen species，ROS）和总谷胱甘肽（total glutathione，t-GSH）试剂盒购自上海碧云天生物技术公司；抗GAPDH、Nrf2、histone H3、谷胱甘肽合成酶（glutathione synthetase，GSS）和GPX4 抗体，羊抗兔Ⅱ抗，铁检测试剂盒，4-羟基壬烯醛（4-hydroxynonenal，4-HNE）试剂盒和TUNEL 凋亡试剂盒购自Abcam；cleaved caspase-3、HO-1 和铁死亡抑制蛋白1（ferroptosis suppressor protein 1，FSP1；即AIFM2）抗体均购自Affinity。酶标仪购自Thermo；荧光和普通显微镜购自Leica；荧光定量PCR 仪和电泳转膜仪器购自Bio-Rad。

3 主要方法

3.1 SAP 模型的建立 大鼠术前12 h 禁食，自由饮水。经腹部皮下注射1%戊巴比妥钠（40 mg/kg）麻醉后行开腹手术，参照文献［7］，经十二指肠逆行用微量注射泵将5%牛磺胆酸钠（1 mg/kg）以0.1 mL/min 匀速泵入胰胆管，持续10 min，移开注射泵并逐层缝合腹部伤口。假手术（sham）组行开腹手术后，仅触碰胰胆管部位。

3.2 动物分组及给药 将大鼠采用随机数字法分组为sham 组、SAP 组、OLA+SAP 组、FER1+SAP 组和OLA+BRU+SAP 组，每 组8 只。OLA+SAP 组在注 射牛磺胆钠酸后0.5、3 和6 h 先腹腔注射生理盐水，再立即给予60 mg/kg OLA 灌胃［12］；FER1+SAP 组在注射牛磺胆钠酸后0.5、3 和6 h 先腹腔注射2 mg/kg FER1［13］，再立即给予生理盐水灌胃；OLA+BRU+SAP组在给予OLA 前腹腔注射2 mg/kg BRU［5］；sham 组和SAP组同步灌胃和腹腔注射生理盐水。

3.3 样本采集 造模后6 h（即末次给药后）经尾静脉取血，4 ℃离心分离血清。造模后12 h（即末次给药后6 h），处死大鼠取腹主动脉血，4 ℃离心分离血清；随后分离胰脏及肝脏，冲净后将肝脏分为3 份，一份置于-80 ℃冻存；一份与胰脏一起用4%多聚甲醛浸没固定，分别制备5µm 厚的胰脏和肝脏石蜡切片；一份制备新鲜肝脏组织匀浆液。

3.4 HE 和TUNEL 染色 用HE 试剂盒分别对3.3中胰脏和肝脏石蜡切片染色，普通显微镜下观察胰脏和肝脏形态变化。另外用TUNEL 试剂盒染色后观察肝细胞死亡情况，荧光显微镜下拍照，ImageJ 软件分析肝细胞凋亡率。凋亡率（%）=（凋亡肝细胞TUNEL+数量/视野下总肝细胞DAPI+数量）×100%。

3.5 血清指标测定 用自动分析仪联合ALT、AST、TBA、ALB 及AMY 试剂盒测定3.3 中血清的各指标水平。

3.6 肝组织MDA、ROS、4-HNE、t-GSH 水平及铁含量测定 取3.3 中新鲜肝脏组织匀浆液，离心取上清，测定蛋白浓度后，用酶标仪联合MDA、ROS、4-HNE、t-GSH及铁检测试剂盒，测定各指标水平。

3.7 Western blot 检测 分别使用总蛋白和核蛋白提取试剂盒从3.3 中冷冻肝组织中提取总蛋白和核蛋白，并定量。取30µg蛋白通过凝胶电泳分离并转印到PVDF 膜上，将膜用5%脱脂奶粉封闭，用Ⅰ抗（GAPDH、Nrf2、histone H3、cleaved caspase-3、HO-1、GSS、GPX4和FSP1）稀释液（GAPDH 为1∶2 000，其他均为1∶1 000）孵育过夜，再用羊抗兔Ⅱ抗稀释液（1∶2 000）孵育60 min，最后用ECL 发光液避光孵育5 min。将膜置于蛋白凝胶成像仪中拍照并分析蛋白条带灰度。

4 统计学处理

实验数据用平均数±标准差（mean±SD）描述并使用GraphPad Prism 8.0 软件进行分析。用单因素方差分析行多组间比较，用SNK-q检验行两两比较。以P＜0.05时为差异有统计学意义。

结果

1 各组大鼠血清生化指标的比较

造模后6 和12 h，相较于sham 组，SAP 组血清ALT、AST、TBA、AMY 水平升高（P＜0.05），ALB 水平降低（P＜0.05）；造模后6 h，相较于SAP组，OLA+SAP组、FER1+SAP 组血清AMY 水平降低（P＜0.05）；造模后6 h，相较于OLA+SAP 组，FER1+SAP 组、OLA+BRU+SAP 组血清AMY 水平升高（P＜0.05）；造模后12 h，相较于SAP组，OLA+SAP组、FER1+SAP组血清ALT、AST、TBA、AMY 水平降低（P＜0.05），ALB 水平升高（P＜0.05）；造模后12 h，相较于OLA+SAP 组，FER1+SAP 组、OLA+BRU+SAP 组血清ALT、AST、TBA、AMY 水平升高（P＜0.05），ALB 水平降低（P＜0.05），见表1。

表1 各组ALT、AST、TBA、ALB及AMY水平的比较Table 1.Comparison of ALT，AST，TBA，ALB and AMY levels in the 5 groups（Mean±SD. n=8）

2 各组大鼠胰腺及肝组织形态的比较

sham组胰腺及肝细胞胞膜、胞核结构完整，排列整齐，均未见炎性细胞；SAP 组胰腺及肝叶间隙增大，细胞排列不规则且细胞肿胀变形，可见较多炎性细胞；OLA+SAP 组、FER1+SAP 组胰腺及肝损伤明显缓解，且OLA+SAP 组改善效果优于FER1+SAP 组；OLA+BRU+SAP组较OLA+SAP组加重，见图1。

Figure 1.Morphological changes of pancreatic and liver tissues in the 5 groups（HE staining，scale bar=100µm）.图1 各组胰腺和肝组织形态的比较

3 各组大鼠肝细胞凋亡的比较

相较于sham 组，SAP 组cleaved caspase-3 蛋白水平和肝细胞凋亡率显著增加（P＜0.05）；相较于SAP组，OLA+SAP 组和FER1+SAP 组cleaved caspase-3 蛋白水平和肝细胞凋亡率显著降低（P＜0.05）；相较于OLA+SAP 组，FER1+SAP 组 和OLA+BRU+SAP 组cleaved caspase-3 蛋白水平和肝细胞凋亡率显著增高（P＜0.05），见图2、3。

Figure 2.TUNEL assay was used to detect hepatocyte apoptosis.The scale bar=50 µm.Mean±SD. n=8.*P＜0.05 vs sham group；#P＜0.05 vs SAP group；△P＜0.05 vs OLA+SAP group.图2 TUNEL染色检测肝细胞凋亡

4 各组大鼠肝组织中氧化应激指标的比较

Figure 3.Comparison of liver cleaved caspase-3 protein level in the 5 groups.Mean±SD. n=8.*P＜0.05 vs sham group；#P＜0.05 vs SAP group；△P＜0.05 vs OLA+SAP group.图3 各组肝脏cleaved caspase-3的比较

相较于sham 组，SAP 组肝组织中ROS、MDA 和4-HNE水平显著增高（P＜0.05），t-GSH水平显著降低（P＜0.05）；相较于SAP组，OLA+SAP 组和FER1+SAP组肝组织中ROS、MDA 和4-HNE 水平显著降低（P＜0.05），t-GSH 水平显著增高（P＜0.05）；相较于OLA+SAP 组，OLA+BRU+SAP 组肝组织中ROS、MDA 和4-HNE 水平显著增高（P＜0.05），t-GSH 水平显著降低（P＜0.05），见表2。

表2 各组ROS、MDA、4-HNE及t-GSH水平的比较Table 2.Comparison of ROS，MDA，4-HNE and t-GSH levels in the 5 groups（Mean±SD. n=8）

5 各组大鼠肝组织中铁含量的比较

相较于sham 组，SAP 组肝组织中铁含量显著增加（P＜0.05）；相较于SAP 组，OLA+SAP 组、FER1+SAP 组肝组织中铁含量显著减少（P＜0.05）；相较于OLA+SAP 组，FER1+SAP 组、OLA+BRU+SAP 组肝组织中铁含量显著增加（P＜0.05），见图4。

Figure 4.Comparison of iron content in the 5 groups.Mean±SD.n=8.*P＜0.05 vs sham group；#P＜0.05 vs SAP group；△P＜0.05 vs OLA+SAP group.图4 各组铁含量比较

6 各组大鼠肝组织中Nrf2-抗铁死亡轴相关蛋白表达的比较

相较于sham 组，SAP 组核蛋白及总蛋白中Nrf2水平，总蛋白中HO-1、GSS、GPX4 和FSP1 水平显著降 低（P＜0.05）；相较于SAP 组，OLA+SAP 组 和FER1+SAP 组核蛋白及总蛋白中Nrf2 水平，总蛋白中HO-1、GSS、GPX4 和FSP1 水平显 著增加（P＜0.05）；相较于OLA+SAP 组，FER1+SAP 组和OLA+BRU+SAP 组核蛋白及总蛋白中Nrf2 水平，总蛋白中HO-1、GSS、GPX4 和FSP1 水平显著降低（P＜0.05），见图5。

讨 论

SAP 肝损伤涉及炎症和过氧化等共同作用。OLA 在抑制肝脏炎症和脂肪累积［14］、抑制肝纤维化［15］、提高脂肪代谢［16］及改善肝脏氧化应激和胆汁代谢［17］的效果已被证实，这是其作为保肝药物的基础。研究显示，OLA 可改善肝纤维化大鼠的肝功能血清指标，减轻肝中炎症和细胞坏死［15］。本研究中SAP 大鼠经OLA 治疗12 h 后，胰腺和肝形态损伤均减轻，且血清ALT、AST、TBA 及AMY 水平降低，ALB水平升高。胰腺或肝细胞出现损伤后，细胞内AMY、ALT 和AST 等代谢酶释放入血，且肝细胞代谢胆红素及合成ALB 等蛋白的能力降低，表现为血清水平异常［17］。本研究在SAP 大鼠中也观察到与人类胰腺和肝细胞损伤类似的血清指标变化，提示OLA 可改善SAP 大鼠肝脏合成代谢能力，保护胰腺和肝细胞结构完整，对SAP肝损伤也有治疗作用。

Figure 5.Comparison of the expression of Nrf2-antiferroptosis axis-related proteins in the 5 groups.Mean±SD. n=8.*P＜0.05 vs sham group；#P＜0.05 vs SAP group；△P＜0.05 vs OLA+SAP group.图5 各组Nrf2-抗铁死亡轴相关蛋白表达的比较

过度氧化应激是急性炎症性疾病中细胞损伤的重要原因，研究显示，氧化应激和相关ROS的累积在AP 的胰腺腺泡细胞损伤中起主要作用［18］。过量的ROS 可对核酸和脂质等进行氧化修饰破坏它们的功能，如果细胞内Fe2+水平升高，则可能发生铁死亡［19］。通常情况下，机体内循环铁主要与转铁蛋白结合并以Fe3+形式存在，当机体铁稳态失衡时，Fe3+通过细胞膜上的转铁蛋白受体进入细胞，被还原为具有活性的Fe2+，这些Fe2+进一步将脂质过氧化物转化为ROS，引起细胞铁死亡［20］。因此，ROS、脂质过氧化物和Fe2+的产生及累积是诱导铁死亡的基础。本研究在SAP 大鼠肝脏中检测到细胞死亡率、铁离子含量、ROS、MDA 和4-HNE 水平增高，t-GSH 水平降低，且铁死亡抑制剂FER1 可减轻SAP 大鼠肝中脂质过氧化程度、铁累积及细胞死亡，说明铁死亡参与SAP 肝损伤过程。研究显示，抑制氧化应激可抑制急性肝衰竭铁死亡，可以降低病理损伤，改善肝功能［21］。本研究中，OLA 治疗可明显增加SAP 大鼠t-GSH 水平，减少细胞死亡率、铁离子含量及ROS、MDA和4-HNE水平，提示OLA 可减少铁死亡所需的脂质氧化物和铁累积，具有抑制铁死亡的活性。

铁死亡是依赖于铁的脂质过氧化性细胞死亡，GSH、HO-1、GPX4 及FPS 等抗氧化分子或酶共同组成抗铁死亡轴，抵抗铁死亡。GSS 为合成GSH 所必需的酶，而GPX4 可与GSH 共同作用，将脂质过氧化物还原为无细胞毒性的脂质醇，是铁死亡的重要调节因子，当GSH合成受阻时，GPX4的活性下降，细胞抗氧化能力下降，导致ROS 积累，促进铁死亡［22-23］。FSP为铁死亡抑制蛋白，可通过促进辅酶Q10再生增强机体对脂质过氧化自由基的还原能力，和GPX 途径平行发挥作用［13，24］。Nrf2 通路是细胞内源性抗氧化机制，可以被氧化刺激入核活化，诱导下游信号分子HO-1、GSS 和GPX4 等的表达，以发挥抗氧化应激反应［25］。此外，Nrf2 通路的激活已被证实可阻碍铁死亡［25］，而铁死亡是炎症性疾病的治疗靶点［26］。本研究中，OLA 可显著增加SAP 大鼠肝组织核蛋白及总蛋白中Nrf2 水平，总蛋白中HO-1、GSS、GPX4 及FSP1水平，提示OLA 可促进大鼠肝中Nrf2-抗铁死亡轴活化。进一步研究显示，Nrf2 抑制剂BRU 可减弱OLA 对SAP 肝损伤的作用及对氧化应激、铁死亡的抵抗作用，提示Nrf2-抗铁死亡轴在OLA 保护SAP 大鼠肝损伤中发挥作用。

综上所述，铁死亡参与SAP 大鼠肝损伤过程，OLA 可通过激活Nrf2-抗铁死亡轴抵抗细胞铁死亡，减轻SAP 大鼠肝损伤。另外，SAP 肝损伤还涉及肌醇需求酶1α 介导的内质网相关凋亡通路［27］、TLR4/NF-κB p65 介导的炎症通路［28］，结合本研究内容，推测OLA可能通过多途径发挥对SAP肝损伤的保护。