荧光光谱法探究pH值对叶黄素与牛血清白蛋白相互作用的影响

范金波，康 柱，张 炎，苏冬雨，周素珍，吕长鑫

（渤海大学食品科学与工程学院，辽宁省食品安全重点实验室，生鲜农产品贮藏加工及安全控制技术国家地方联合工程研究中心，辽宁 锦州 121013）

牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）是人血清白蛋白（human serum albumin，HSA）的同源蛋白，由3 个结构同源的螺旋结构域（I、II和III）组成，每个螺旋结构域都包含2 个亚结构域（A和B），并且位于白蛋白上药物结合位点的主要区域在IIA和IIIA子域的疏水腔中。BSA螺旋结构相对于其他蛋白质比较薄弱，与其他物质的连接位置容易更改，所以BSA能够与脂溶性或水溶性物质发生结合作用。由于BSA相对HSA易提取，成本较低，可作为载体携带小分子作用于相应部位，发生相应的活性作用，因此研究BSA与小分子结合对小分子的活性保护和靶向传递有着重要意义。

类胡萝卜素广泛存在于植物中，种类多样，具有抗癌、抗炎、抗氧化、抑菌、抑血栓等多种活性作用。其中，叶黄素是人体视网膜黄斑的组成成分，具有保护视网膜和预防心血管疾病的作用。然而因叶黄素稳定性差，易受光、氧、热等环境因素的影响，以及水溶性较差的特点，导致其生物利用度低，限制了其应用。因此，通过蛋白基载体实现叶黄素的保护和靶向递送已经成为研究的热点。

目前，药物、生物活性小分子等与BSA或HSA相互作用的研究较为普遍，但在不同pH值条件下，叶黄素与BSA的相互作用鲜见报道，亟待深入研究。通过荧光光谱法及分子对接技术研究不同pH值（7.4、5.2、3.0）对叶黄素-BSA相互作用的影响，对于BSA蛋白基载体的开发及活性成分的保护都具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

BSA（98%） 北京百灵威科技有限公司；叶黄素（98%）、布洛芬（ibuprofen，IBUP，98%）、华法林（warfarin，WARF，98%） 生工生物工程（上海）有限公司；其他实验试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

F-7000荧光分光光度计 日本日立高新技术公司；GL124-1SCN电子天平 赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；HY-2旋涡混匀仪、PHS-25 pH计 仪电科学仪器（上海）股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 储备液的配制

配制0.2 mol/L的pH 7.4、5.2、3.0磷酸缓冲液，并配制1.2×10mol/L的BSA储备液，以及7.2×10mol/L叶黄素、IBUP、WARF储备液。

1.3.2 叶黄素与BSA相互作用的荧光光谱测定

荧光发射光谱：向离心管中加入一定量的磷酸缓冲液，再加入1.2×10mol/L BSA溶液30 μL，最后加入叶黄素溶液，最终离心管中溶液总体积为3 mL，使之充分反应30 min。分别在298 K和310 K温度下，设置激发波长为280 nm，发射波长为290～450 nm，以700 nm/min的扫描速率进行荧光发射光谱的测定。

同步荧光光谱：在298 K温度下，固定和的波长间隔分别为Δ=60 nm和Δ=15 nm，分别测定样品在250～350 nm的同步荧光光谱并记录。

1.3.3 叶黄素与BSA的结合位点

参照1.3.2节方法，在加入叶黄素溶液前，先加入7.2×10mol/L WARF/IBUP溶液25 μL，使其混匀充分反应20 min，再加入叶黄素溶液，后续操作同1.3.2节，并设置对照组。

1.3.4 分子对接

运用Autodock Vina软件进行分子对接。在RCSB PDB蛋白质数据库中选取BSA（ID∶4OR0）的3D结构，保留A链并去除结构中的水分子，添加H原子；PubChem数据库中选取叶黄素（CID:5281243）的3D结构。设置对接区域以覆盖受体分子的大部分，BSA设为刚性对接，叶黄素设为柔性对接，其他参数设置保持默认。从结果中选择结合能最低的对接构象，利用Discovery Studio 2017 R2和Pymol软件进行作图分析。

1.4 数据处理

2 结果与分析

2.1 叶黄素与BSA相互作用的荧光光谱分析

如图1所示，298 K、不同pH值条件下，叶黄素对BSA均产生荧光猝灭现象，且荧光强度随着叶黄素浓度的升高而逐渐降低。pH 7.4～3.0时，BSA的荧光强度峰值分别降低了43%、46%和39%。当pH 7.4时，最大发射波长（）在340 nm处，没有发生明显的位移；pH 5.2时，发生微弱蓝移（339～337 nm）；pH 3.0时，发生红移（325～329 nm）。这可能是因为pH值使叶黄素与BSA相互作用的微环境发生了变化。由图1D可知，随着叶黄素浓度的增大，猝灭率逐渐增大。pH 5.2的猝灭率最高，pH 7.4和pH 3.0的猝灭率相差不大。

图1 298 K条件下pH值对叶黄素与BSA结合影响的荧光光谱Fig. 1 Fluorescence spectra of lutein-BSA complex at different pH conditions and 298 K

由图2可知，在310 K时，不同pH值条件下叶黄素对BSA均产生荧光猝灭作用。当pH 7.4、5.2和3.0时，BSA的荧光强度峰值分别降低了46%、35%和31%。在pH 7.4、5.2和3.0时，随着叶黄素浓度的增大，BSA的分别红移2 nm（338～340 nm）、蓝移2 nm（337～335 nm）、红移5 nm（324～329 nm）。这说明叶黄素与BSA发生了相互作用，同时加之pH值变化的影响，使荧光基团附近的微环境发生变化。在不同pH值条件下，与298 K相比，均有明显的位移现象，说明温度也影响了其相互作用的微环境。由图2D可知，在同一叶黄素浓度下，随着pH值的升高，猝灭率逐渐增大，pH 7.4时，猝灭率最高，说明pH值影响了叶黄素与BSA的结合作用。

图2 310 K条件下pH值对叶黄素与BSA结合影响的荧光光谱Fig. 2 Fluorescence spectra of lutein-BSA complex at different pH conditions and 310 K

2.2 荧光猝灭机理和结合常数

通常荧光猝灭用来反映蛋白质与活性成分之间的相互作用，荧光猝灭类型有2 种，分别是动态猝灭和静态猝灭，2 种方式均可以降低生物大分子的荧光强度。本实验采用Stern-Volmer方程（1）和Hill方程（2）分析小分子与蛋白的结合作用和荧光猝灭机理。

式中：和分别为猝灭剂加入前后荧光体的荧光强度峰值；[]为猝灭剂浓度/（mol/L）；为未加猝灭剂时荧光体的平均寿命/（10s）；为Stern-Volmer猝灭常数/（L/mol）；为生物分子猝灭速率常数/（L/（mol·s））；为表观结合常数/（L/mol）；为结合位点数。

表1 叶黄素与BSA相互作用的常数Table 1 Interaction constants between lutein and BSA

由表1可知，在相同pH值条件下，随温度的升高呈现下降的趋势，且均大于2×10L/（mol•s）（生物分子的最大散射碰撞猝灭常数），说明叶黄素对BSA产生的荧光猝灭类型为静态猝灭；在相同温度条件下，也受pH值变化的影响，随着pH值的增加而上升，当pH 7.4时，最大，与图2D的结果相互验证。在2 个温度下，均在1左右，表明BSA提供一个位点与叶黄素结合。血清白蛋白与药物的结合常数常在10～10L/mol之间，由表1可知，BSA与叶黄素的结合常数在10～10L/mol数量级，表明叶黄素和BSA的结合能力较强。的值越接近于1，说明数据越精确。

2.3 热力学性质分析和作用力类型

生物活性小分子与BSA相互作用时，二者之间主要由疏水相互作用、静电相互作用、范德华力和氢键等维持。当温度不变或温差较小时，Δ可认为是定值或常数。通过Van’ t Hoff方程（3）和方程（4）计算相关参数，分析其作用力。

式中：、对应（298 K）、（310 K）时叶黄素与BSA的结合常数；Δ为吉布斯自由能变化/（kJ/mol）；Δ为熵变/（J/（mol·K））；Δ为焓变/（kJ/mol）；R为气体常数，8.314 J/（mol·K）。

表2 叶黄素与BSA相互作用的热力学参数Table 2 Thermodynamic constants of interaction between lutein and BSA

对于热力学常数与相互作用力的关系，一般认为，当Δ＜0或Δ≈0，Δ＞0，静电相互作用作为结合的主要驱动力；Δ＞0，Δ＜0时，通过静电和疏水相互作用结合；Δ＜0，Δ＜0时，结合的主要驱动力是氢键与范德华力；Δ＞0，Δ＞0时，结合的主要作用力为疏水相互作用。由表2可知，叶黄素与BSA结合时，Δ＞0，Δ＞0，Δ＜0，说明该相互作用，是熵增加、吉布斯自由能升高的吸热过程，主要作用力是疏水相互作用。在3 种不同pH值条件下，热力学常数的方向没有发生变化，说明pH值对二者间的相互作用力和反应类型没有影响。

2.4 同步荧光光谱的测定

由于蛋白质中含有对微环境敏感的氨基酸，这些氨基酸具有特定的荧光吸收峰，而同步荧光具有选择性高的特点，故同步荧光光谱常用来评价活性小分子结合作用引起的蛋白质微环境的变化。本实验通过同步荧光光谱，判断叶黄素对BSA构象的改变。同步荧光光谱中，Δ=15 nm和Δ=60 nm分别反映酪氨酸（Tyr）残基和色氨酸（Trp）残基的特征光谱。

如图3所示，298 K，当Δ=15 nm时，Tyr残基的荧光强度依次减弱，在pH 5.2和pH 7.4条件下，对应氨基酸残基的略微红移1 nm，pH 3.0时未发生变化；当Δ=60 nm时，在3 个pH值条件下，Trp残基的均略微红移1 nm。随着pH值的逐渐增大，Trp残基的荧光强度下降更为明显。由此可以推测，叶黄素与BSA的结合位点在Trp残基附近，且叶黄素的加入和pH值的影响共同改变了BSA构象。

图3 298 K条件下pH 3.0（A）、5.2（B）和7.4（C）时叶黄素与BSA相互作用的同步荧光光谱Fig. 3 Synchronous fluorescence spectra of interaction between lutein and BSA at pH 3.0 (A), 5.2 (B), and 7.4 (C) and 298 K

2.5 叶黄素与牛血清白蛋白结合位点分析

BSA的亚结构域IIA（Sudlow’s site I）和亚结构域IIIA（Sudlow’s site II）分别是WARF和IBUP的特异性结合位点。本实验将IBUP和WARF作为位点Marker，通过竞争性结合实验，比较猝灭率的变化判断叶黄素与BSA的结合位点。

由图4A、B可知，pH 7.4和pH 5.2时，WARF和IBUP的加入，均影响了叶黄素与BSA的相互作用，使得荧光猝灭率下降；但IBUP的加入对叶黄素对BSA的荧光猝灭现象更显著，进而可推测出叶黄素与BSA的结合位点位于亚结构域IIA和IIIA之间，但更接近于亚结构域IIIA，即Sudlow’s site II附近。

由图4C可知，pH 3.0时，WARF和IBUP的存在对叶黄素与BSA的荧光猝灭现象没有显著影响，结合位点既不在亚结构域IIA附近，也不在亚结构域IIIA附近。说明pH值影响了叶黄素与BSA的结合，pH值不同结合位点也不同。

图4 298 K条件下pH 7.4（A）、5.2（B）和3.0（C）时IBUP和WARF对叶黄素与BSA结合的影响Fig. 4 Effect of IBUP and WARF on the interaction between lutein and BSA at pH 7.4 (A), 5.2 (B), and 3.0 (C) and 298 K

2.6 分子对接

分子模拟是研究叶黄素与BSA等生物大分子结合位点的有效方法。通Autodock Vina软件研究叶黄素和BSA的分子对接，最佳构象Δ=－33 kJ/mol，和荧光结果相差不大。由图5可知，叶黄素与BSA的结合位点位于亚结构域IIA和IIIA之间。此外叶黄素与BSA间的相互作用力以疏水相互作用为主（主要为Leu259、Leu237、Lys187、Arg435等氨基酸残基形成），其次还有少许氢键（主要为Arg256、Ser286、Ala260等氨基酸残基形成）和静电相互作用（主要为Tyr149、His241等氨基酸残基形成）（表3）。这与位点Marker实验和热力学性质分析的结果一致。

图5 叶黄素与BSA的可能结合位点、氨基酸残基和作用力Fig. 5 Possible binding sites, amino acid residues and interaction forces of lutein and BSA

表3 叶黄素与BSA相互作用的结合位点氨基酸残基，作用力及吉布斯自由能Table 3 Amino acid residues, binding force and Gibbs free energy of the interaction between lutein and BSA

3 结 论

采用荧光光谱法，研究在pH 7.4、5.2、3.0条件下叶黄素与BSA的相互作用。结果表明，在3 种pH值条件下，叶黄素对BSA均产生荧光猝灭效应。通过荧光猝灭机理分析，该猝灭类型属于静态猝灭，且在pH 7.4时，猝灭效应最为明显，同时结合常数达到10数量级，由此说明在生理条件下叶黄素与BSA更易结合；经热力学分析可知，二者结合作用力主要是疏水相互作用；同步荧光结果表明，叶黄素的加入和pH值的影响共同改变了BSA的构象；位点竞争实验和分子对接技术结果显示，叶黄素与BSA的结合位点受pH值的影响。实验结果表明，pH值的变化影响了叶黄素与BSA的结合，且pH值的增加促进了二者的结合，这对于在分子水平上认识叶黄素与BSA相互作用的机理，以及BSA蛋白基载体的开发提供了实验依据。