新型分子印迹聚合物修饰的选择性离子源结合电喷雾电离质谱快速检测莠灭净和莠去津

马洪悦，杨敏莉，张 峰,*，杨丙成，章飞芳,*

（1.华东理工大学药学院，制药工程与过程化学教育部工程研究中心，上海 200237；2.中国检验检疫科学研究院 国家市场监管重点实验室（食品质量与安全），北京 100176）

莠灭净和莠去津属于三嗪类除草剂，化学结构式如表1所示，在农作物种植过程中应用较为广泛。然而三嗪类除草剂具有高毒性，人体长期接触可能会造成接触性皮炎，如果其残留通过食品、地表径流和地下水的污染进入人体，会造成人体畸变或诱导致癌，因此开发出能够有效检测食品中三嗪类农药残留的方法具有重要意义。

表1 莠灭净和莠去津的化学结构式Table 1 Chemical structures of ametryn and atrazine

目前，三嗪类除草剂等农药残留的检测主要借助气相色谱、液相色谱、气相色谱-串联质谱、高效液相色谱-串联质谱等方法。但这些检测方法均离不开样品前处理步骤，才能将复杂基质中的痕量目标物有效提取，固相萃取是常用的前处理方法，例如Bichon等利用固相萃取与加压液体萃取相结合，在冻干牡蛎中提取了5 种三嗪类农药；Wang Shanshan等利用双模板分子印迹聚合物（molecularly imprinted polymer，MIP）在玉米、小麦和棉籽样品中富集了17 种三嗪类农药。但这些检测方法在应用过程中都具有明显的缺点，即需要较长时间的色谱分离和复杂的样品前处理。同时，液相色谱主要是依靠色谱柱对不同物质之间的保留时间不同而达到分离目标物的效果，色谱柱正确选择、流动相的比例调整、洗脱梯度的合理设置均对色谱分离至关重要，这些因素使气相色谱、液相色谱、气相色谱-串联质谱、液相色谱-串联质谱在快速检测领域的应用具有一定的局限性。

近20年间，敞开式质谱技术因其不需要色谱分离的优势而迅速发展，一定程度上弥补了气相色谱和液相色谱技术的缺点，实现了仅需少量或无需前处理直接在原位检测痕量目标物。敞开式质谱检测技术的发展得益于敞开式离子源的开发，目前已报道的有40多种，例如，解吸电喷雾电离，直接实时分析，常压固体分析探针，介质阻挡放电电离，纸喷雾电离，快速蒸发电离等。为了进一步提高敞开式质谱离子源的选择性，有研究人员将一系列的纳米吸附材料与敞开式离子源结合，实现了对目标物更快更精准的检测。

本研究将分子印迹技术与敞开式质谱技术相结合，开发一种快速检测食品中莠灭净和莠去津的方法。以铁片为固体基板，氰草津为虚拟模板，使用苯胺和甲基丙烯酸在水溶液中合成了集选择性富集和快速检测为一体的敞开式离子源，经过实验验证，该方法操作简单、高效省时、灵敏度高，可实现对食品中μg/kg级莠灭净和莠去津的快速检测。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

莠灭净（纯度98.0%）、莠去津（纯度99.1%）、氰草津（纯度97.4%）、磺胺对甲氧嘧啶（纯度99.3%）德国Dr. Ehrenstorfer. GmbH公司；甲基丙烯酸（纯度99%） 美国Sigma-Aldrich公司；过硫酸铵（纯度＞99%），乙腈、丙酮、甲醇、乙醇（均为分析纯）赛默飞世尔科技（中国）有限公司；正硅酸四乙酯（以SiO计≥28.4%）、苯胺（纯度98.0%）、氨水（25.0%～28.0%） 国药集团化学试剂有限公司；3-(甲基丙烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷（3-(trimethoxysily)propyl methacrylate，MPS）（纯度＞98.0%） 东京化成工业株式会社；苯胺（纯度98.0%），甲酸、乙酸（纯度＞99.7%） 上海安谱实验科技股份有限公司；硫酸（98.08%） 韩国德山公司；实验用水由Milli-Q超纯水系统制备；铁片购自北京市某五金店。

1.2 仪器与设备

QTRAP 5500质谱仪 美国AB Sciex公司；G560E涡旋振荡器 美国Scientific Industries公司；DW-P103-1ACE0高压电源 天津东文高压电源有限公司；KQ-500DE超声清洗机 昆山市超声仪器有限公司；MFV-24氮吹仪 广州得泰仪器科技有限公司；BV1010多管振荡仪 美国Benchman公司；超纯水机 美国Millipore公司；PHS-25型号pH计 上海仪电科学仪器股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 分子印迹聚合物修饰铁片（molecularly imprinted polymer modified iron sheet，MIPIS）及非分子印迹聚合物修饰铁片（non molecularly imprinted polymer modified iron sheet，NIPIS）的制备

MIPIS的制备过程主要包括铁片的表面改性及MIP涂覆两个步骤。

1.3.1.1 铁片的表面改性

铁片表面改性处理参考文献[24]的方法：包括表面酸处理和双键化修饰2 个过程。对铁片进行酸处理是为了有效去除铁片表面的镀锌层，暴露出内部的四氧化三铁，有利于后续对铁片进行修饰。铁片表面硅氧化修饰后，接枝双键能够为之后MIP的聚合过程提供反应位点。

首先，将厚度为0.3 mm的铁片剪裁为1 cm×2 cm（底、高）的等腰三角形，以2 mol/L硫酸超声处理铁片约1 h，直至铁片边缘呈现微锯齿形，超声结束后，用超纯水反复洗涤铁片至表面呈中性，再以适量丙酮冲洗，用氮气吹干。之后，将处理后的铁片放入盛有4 mL超纯水、50 mL乙醇的锥形瓶中，缓慢滴加5 mL浓氨水和2 mL正硅酸四乙酯，将其置于摇床上，以180 r/min室温反应12 h，反应结束后分别使用超纯水和乙醇冲洗并吹干，得到表面修饰硅氧键的IS@SiO。将所得的IS@SiO浸入60 mL甲醇溶液中，逐滴加入2 mL MPS，置于摇床上，以相同的速度室温反应24 h，反应结束后用乙醇反复冲洗产物3～5 次，用氮气吹干，最终得到表面修饰双键的IS@SiO@MPS。

1.3.1.2 IS涂覆MIP

将30 mg氰草津和90 μL甲基丙烯酸溶于50 mL水中，放入1 片IS@SiO@MPS，置于摇床上，以180 r/min反应30 min。随后加入100 mg苯胺、66 mg过硫酸铵和1 mL 1.0 mol/L HCl溶液，在常温条件下以相同的速率反应24 h。合成的产物用超纯水洗涤数次，用甲醇冲洗，并用氮气吹干。以甲醇-乙酸（95∶5，/））为洗脱剂，在索氏抽提器中去除聚合物中的模板分子，得到MIPIS。NIPIS的制备除不加模板分子外，其他步骤与MIPIS的制备过程相同。

1.3.2 样品制备

首先，称取2 mg豆奶粉样品，加入15 mL乙腈，涡旋振荡1 min，超声3 min，4 ℃、8 000 r/min离心10 min，收集上清液，用氮气吹至近干，用15 mL甲醇溶液复溶，所得溶液作为待测液。实验中其他样品的前处理流程与之相同。

1.3.3 MIPIS萃取样品

取10 mL待测液于样品瓶中，加入1 片MIPIS，置于摇床上，180 r/min振摇20 min。MIPIS取出晾干后利用铜夹将其固定在搭建好的3D移动平台上，调整MIPIS角度，使其尖端距离质谱进样口约1 cm。在MIPIS表面滴加10 μL 0.2% 氨水-甲醇溶液，接入3.3 kV的高压电源后，直接进行质谱检测。

1.3.4 质谱检测

质谱检测采用正离子条件下的多反应监测模式，使用Analyst软件对莠灭净和莠去津定量离子产生的峰面积进行定量，相关质谱参数见表2。

表2 莠灭净和莠去津的母离子、子离子、去簇电压和碰撞能Table 2 Parent ions, product ions, de-clustering potential and collision energy for ametryn and atrazine

1.3.5 方法学考察

实验分别配制了质量浓度范围为0.2～200 μg/L的基质待测溶液和溶剂待测溶液，利用MIPIS对其进行富集并检测，并绘制基质标准曲线和溶剂标准曲线用于判定方法的基质效应。基质效应是影响外标法准确定量的重要因素，按下式计算基质效应（）：

式中：和分别为基质标准曲线和溶剂标准曲线的斜率。

2 结果与分析

2.1 扫描电镜表征

材料的表面形貌一般可通过扫描电镜进行表征。为了观察MIPIS和NIPIS的表面形貌，对各个反应阶段的产物进行了扫描电镜表征。如图1所示，原始铁片（图1A）表面较为光滑，经过酸化反应以及硅氧化修饰后，得到图1B，可以看出镀锌层基本都被腐蚀，铁片表面呈现凹凸不平的形态，且表面接枝较多的球状基团，为后续的MIP的修饰提供了反应位点。由图1C、D可以看出，材料表面呈现蜂窝状，有较多的孔穴，为吸附待测物提供了条件。

图1 扫描电镜表征Fig. 1 SEM images

2.2 提取条件和质谱条件优化

不同提取条件会对目标物的提取效果产生影响，本研究在加标量为50 μg/kg的豆奶粉样品混合溶液中对提取溶剂，提取时间以及提取液pH值进行优化，结果如图2所示。

选择合适的提取溶剂是萃取过程的关键因素，实验选取丙酮、乙酸乙酯和乙腈3 种常用的提取溶剂对样品中的莠去津和莠灭净进行提取，并对MIPIS富集的目标物进行检测。由图2A可知，相比于丙酮和乙酸乙酯，乙腈作为提取溶剂时MIPIS富集到的目标物更多，检测得到的峰面积更高，所以乙腈对莠灭净和莠去津的提取效果更好。由于莠灭净和莠去津属于中等极性的农药，而乙酸乙酯更适合提取一些极性较大的物质，因此乙酸乙酯对莠灭净和莠去津的提取能力稍弱。同时，乙腈具有沉淀蛋白质的作用，有利于降低样品中的基质干扰，从而提高提取效率；并且乙腈具有极易挥发的特性，这更有利于提取液的吹干和复溶过程。因此，实验选择乙腈作为提取溶剂。

MIPIS对目标物的富集是一个动态过程，因此实验分别对提取时间为5、10、20、25 min和30 min条件下MIPIS富集的目标物含量进行了考察，如图2B所示，莠灭净的定量离子形成的峰面积在前20 min呈现不断增加的趋势，在20 min达到最大值，在20～30 min内，样品基质内的大分子对于吸附位点的干扰，造成峰面积值有轻微下降，基本达到动态平衡。莠去津在提取时间为25 min时测得的峰面积值最大，但仅比提取时间为20 min时所测得的峰面积高2.7%。因为提取实验是在2 种目标物的混合溶液中进行，为了统一提取时间，实验选择20 min作为MIPIS对目标物的提取时间。

提取溶液pH值是影响目标物与MIPIS有效结合的重要因素，因为在不同pH值条件下，目标物会呈现不同的离子状态，影响其与MIPIS上的吸附位点的氢键形成。实验分别对提取液pH值为3、5、7、9、10条件下的MIPIS对莠灭净和莠去津的富集量进行了检测，结果如图2C所示。在pH值为7的条件下，MIPIS对莠灭净和莠去津的富集效果最佳，在pH值为3或10的条件下，MIPIS对莠灭净和莠去津的富集效果较差，这可能是由于莠灭净和莠去津在强酸或强碱的条件下不稳定，会发生分解反应。根据莠灭净和莠去津的结构，氨基的氢原子和三嗪环的氮原子会作为结合位点，构建所需的关键相互作用，而甲基丙烯酸中的羧基既是氢键受体又是供体，因此莠灭净和莠去津分别会与甲基丙烯酸形成双氢键。在pH值较低时，由于甲基丙烯酸中的酸性基团和目标物处于质子化形式，这可能使得目标物分子或甲基丙烯酸中的氢键位点直接与水合氢离子相互作用，而不是目标物与MIPIS之间有相互作用。在较高的pH值下，更多的目标物和甲基丙烯酸的酸性基团也呈现离子形式，减少了氢键形成能力。因此，较高或较低的pH值都会导致MIPIS对莠灭净和莠去津的提取效率降低。因此pH值为7被选为提取溶液的最佳pH值。

实验分别对喷雾电压和喷雾溶剂2 个参数进行优化。如图2D所示，分别检测喷雾电压为2.8、3.0、3.3、3.5、3.8 kV和4.0 kV条件下莠灭净和莠去津的定量离子的信号强度。当喷雾电压小于2.8 kV时，由于喷雾溶剂的表面张力较大，不能形成有效喷雾，所以检测不到目标物的信号；当喷雾电压大于2.8 kV时，信号强度随着喷雾电压的增加而不断增加，在喷雾电压达到3.3 kV时，信号强度达到了最大值。而当喷雾电压大于3.3 kV时，信号强度逐渐下降，这是由于喷雾电压过高时，包裹目标物的喷雾溶剂聚集在MIPIS尖端形成大液滴，被快速击散成小液滴喷落在质谱进样口周围，只有少量小液滴形成有效的喷雾进入质谱进样口，造成目标物的信号强度较低。因此，选择3.3 kV作为喷雾电压。

如图2E所示，分别考察甲醇、0.2%甲酸-甲醇和0.2%氨水-甲醇作为喷雾溶剂，对MIPIS上莠灭净和莠去津的洗脱能力。根据各定量离子的峰面积可知，喷雾溶剂为含0.2%氨水-甲醇所洗脱出的莠灭净和莠去津的量最多，其值是喷雾溶剂为甲醇时解吸量的1.19 倍和1.13 倍，是喷雾溶剂为0.2%甲酸-甲醇的1.45 倍和1.39 倍。这是由于碱性条件下，氢键更容易发生断裂，使目标物与MIPIS上的选择性位点更易分离，从而洗脱出更多的目标物。因此选择0.2%氨水-甲醇作为实验的喷雾溶剂。

图2 不同条件下提取莠灭净和莠去津的优化结果Fig. 2 Optimization of the extraction conditions for ametryn and atrazine

2.3 MIPIS材料评价

2.3.1 特异性评价

实验选择磺胺对甲氧嘧啶作为竞争性目标物，通过比较MIPIS和NIPIS对莠灭净、莠去津和磺胺对甲氧嘧啶的吸附能力来评价MIPIS的特异性。在含量为50 μg/kg的加标豆奶粉样品待测液中将一片MIPIS和一片NIPIS分别置于上述溶液中，按1.3.3节平行测定3 次。MIPIS和NIPIS对莠灭净、莠去津和磺胺对甲氧嘧啶的吸附结果如图3所示。结果表明，MIPIS吸附的莠灭净和莠去津对应峰面积是NIPIS的1.6 倍和2.6 倍，这是由于MIPIS具有特异性吸附位点，对目标物吸附容量大，而NIPIS受到样品中其他大分子物质的干扰，因此对目标物的吸附量会降低。图中还可以看出MIPIS和NIPIS由于对磺胺对甲氧嘧啶没有特异性的吸附孔穴，吸附量较小。

图3 MIPIS和NIPIS对莠灭净、莠去津和磺胺对甲氧嘧啶的提取量的比较Fig. 3 Comparison of efficiencies of MIPIS and NIPIS for extraction of ametryn, atrazine and sulfameter

2.3.2 富集效率评价

富集因子是评价固体基板材料富集效率的重要指标，富集因子定义为MIPIS和空白铁片对样品基质中同一浓度目标物的萃取量的比值。在空白豆奶粉样品的待测液中加入莠灭净和莠去津的混合标准溶液，配成50 μg/kg的混合溶液，分别加入一片MIPIS和一片空白铁片，按照1.3.3节平行测定3 次。结果显示MIPIS对莠灭净和莠去津的富集因子分别为22.24±2.30、28.14±3.75，莠灭净的富集因子值稍低于莠去津。从化学结构上看，是由于莠灭净的三嗪环上的取代基团位阻更大，因此在与莠去津竞争MIPIS上的特异性吸附位点时，显示出更弱的竞争力，因此，莠去津的富集值更高一些。

2.4 MIPIS结合电喷雾电离质谱方法学评价

2.4.1 基质效应的考察

基质效应有基质抑制和基质促进作用，其评价标准为：当基质效应大于20%时，表现为明显的基质增强效应；当基质效应小于－20%时，表现为明显的抑制作用；当基质效应在－20%～20%之间时，则基质效应不明显。当基质效应明显时，需要采用基质标准曲线准确定量从而消除基质效应。通过计算，莠灭净和莠去津的基质效应分别为－23.9%和－8.7%，结果说明样品基质对莠灭净具有基质抑制作用，莠去津的基质效应不明显，即对莠灭净来说，MIPIS对豆奶粉样品中的基质干扰抵抗能力较弱。因此，为了获得更准确的定量结果，采用莠灭净和莠去津的基质标准曲线作为定量标准。

2.4.2 标准曲线、LOD与LOQ结果

表3 莠灭净和莠去津在甲醇和豆奶粉中的线性关系、LODs、LOQs、日内精密度和日间精密度Table 3 Linear relationships, LODs, LOQs, intraday and interday precision for the determination of ametryn and atrazine in methanol and soy milk powder

在豆奶粉待测液和甲醇中加入莠灭净和莠去津的混合标准溶液，配制成质量浓度为0.2～200 μg/L的基质标准溶液和溶剂标准溶液，并用MIPIS进行提取，按照1.3.3节方法进行检测，所得标准曲线结果如表3所示。莠灭净和莠去津在0.2～200 μg/L质量浓度范围内线性良好（＞0.998 2）。另外，还测定莠灭净和莠去津检出限（limits of detection，LOD）和定量限（limits of quantification，LOQ），结果如表3所示，LOD范围在0.2～0.5 μg/kg之间，LOQ在0.6～1.5 μg/kg之间，说明MIPIS结合电喷雾电离质谱方法可实现豆奶粉中痕量莠灭净和莠去津残留的灵敏检测。

2.4.3 重复性和再现性结果

通过测定日内精密度和日间精密度用以评价重复性和再现性。通过在1 d内对豆奶粉加标样品连续分析6 次并测定3 d，评价MIPIS结合电喷雾电离质谱方法的重复性和再现性。在空白豆奶粉样品待测液中加入的莠灭净和莠去津混合标准品配制成含量为50 μg/kg的混合溶液，并测定莠灭净和莠去津的RSD。如表3所示，结果表明日内精密度为12.10%和10.63%，日间精密度为8.79%和13.04%，表明MIPIS结合电喷雾电离质谱方法对豆奶粉中莠灭净和莠去津的检测具有良好的重复性和重现性。

2.5 材料重复使用性考察

以吸附-洗脱为一个循环，考察MIPIS的重复使用性。在空白豆奶粉的待测液中加入莠灭净和莠去津的混合标准溶液，配成50 μg/kg的混合溶液，加入一片MIPIS，按照1.3.3节进行检测，计算其回收率。之后用甲醇-乙酸（95∶5，/）浸泡清洗MIPIS，再进行下一次吸附-洗脱，循环了5 次。结果如图4所示，随着使用次数的增加，MIPIS的回收率逐渐下降，这可能是由于每一次的洗脱都会对MIPIS上的吸附位点造成一定量的破坏，并且吸附位点会在有机溶剂中发生溶胀使得有效的吸附位点减少。在这5 次吸附-洗脱循环中，莠灭净和莠去津的回收率分别在79.90%～95.06%之间和82.43%～106.45%之间，证明MIPIS至少可重复使用5 次。

图4 5 个吸附-洗脱循环期间莠灭净和莠去津的回收率Fig. 4 Recoveries of ametryn and atrazine during five adsorption-elution cycles

2.6 实际样品测定及准确度考察

最后，利用所开发的MIPIS结合电喷雾电离质谱方法对购于北京当地超市的豆奶粉，小麦和牛奶样品中的莠灭净和莠去津进行检测，测定结果表明，在这些样品中未检测到莠灭净和莠去津，或是样品中莠灭净和莠去津的含量低于本方法的定量限。之后，在这些样品中加入混合标准溶液配制成10、50μg/kg和100 μg/kg 3 种不同含量的莠灭净和莠去津的混合样品溶液，利用所开发的MIPIS-ESI-MS方法检测莠灭净和莠去津并计算了每类样品中的2 种除草剂的回收率。如表4所示，莠灭净和莠去津的回收率在81.05%～109.66%范围内，RSD在4.03%～15.89%之间，说明准确度良好。

表4 实际样品中莠灭净和莠去津的含量以及不同添加水平的回收率结果Table 4 Contents and recoveries of ametryn and atrazine in real samples with different spiked levels

3 结 论

以氰草津为虚拟模板，利用甲基丙烯酸和苯胺在铁片上合成了一种选择性离子源，结合电喷雾电离质谱，建立了一种快速检测食品基质中痕量莠灭净和莠去津的方法，对豆奶粉，小麦，牛奶三类样品分别以10、50、100 μg/kg 3 个含量进行加标回收实验，平均回收率在81.05%～109.66%之间，RSD为4.03%～15.89%，能够为三嗪类农药残留的快速检测提供一定的参考。