超高效液相色谱-串联质谱法测定食用植物油中典型链格孢霉毒素

兰 丰，王新语，姚 杰，姜 蔚,*，徐静静，孙 林，王志新,*

（1.农业农村部果品及苗木质量监督检验测试中心（烟台），山东 烟台 265500；2.烟台大学生命科学学院，山东 烟台 264005）

近几年，中国每年食用植物油消费量都在3 000万 t以上，已成为全球最大的食用植物油消费国。食用植物油是人体必需脂肪酸的主要来源之一，其质量和安全直接关系到人体的健康。

链格孢属真菌能够产生70余种代谢产物，其中一些有致癌、致畸毒性，典型代表有细交链格孢菌酮酸（tenuazonic acid，TeA）、链格孢酚（alternariol，AOH）、交链格孢酚甲醚（alternariol monomethyl ether，AME）、交链孢烯（altenuene，ALT）和腾毒素（tentoxin，TEN），化学结构见图1。链格孢属真菌能够侵染大豆、油菜、向日葵等，导致油料作物减产，还能产生真菌毒素，继而污染后续加工的食用油。加强食用植物油中链格孢霉毒素的风险监测尤为必要。中国目前尚未制定链格孢霉毒素在食品中的最大允许残留限量，但欧盟自2011年就已开展链格孢酚霉毒素对不同人群的膳食摄入风险评估研究，为制定最大残留限量做准备。

图1 典型链格孢霉毒素化学结构Fig. 1 Chemical structures of typical Alternaria toxins

TeA具有互变异构和旋转异构特性，色谱分离比较困难，以前的研究大都排除TeA，仅测定另外几种毒素，还有的采用柱前衍生法只测定TeA。虽然柱前衍生法改变了TeA的性质、改善了色谱行为，但在实际操作过程中，衍生重现性并不令人满意。链格孢霉毒素的检测在果蔬及其制品方面应用较多，而植物油方面鲜有报道。2020年有研究者使用质谱法同时测定葵花籽油中5 种链格孢霉毒素，运用同位素内标校正基质效应。目前已有的植物油中链格孢霉毒素的检测方法主要使用80%甲醇溶液提取，后续的氮吹浓缩时间过长，部分毒素有损失。此外，由于部分链格孢霉毒素还缺乏相应的同位素标准品，而且费用昂贵，该方法还不能被普遍应用。

针对上述存在的问题，本研究拟从前处理入手，利用正交试验获得较佳的植物油前处理方法，优化色谱和质谱条件，以期建立便于操作和应用的植物油中链格孢霉毒素检测方法，为制定我国食品中链格孢霉毒素限量标准提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

TeA、AOH、AME、ALT和TEN标准物质（纯度均大于98%） 德国Dr. Ehrenstorfor公司；乙腈、甲醇（均为质谱纯） 上海安谱实验科技股份有限公司；碳酸铵（优级纯） 天津市科密欧化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

LC-MS 8040液相色谱-串联质谱仪 日本岛津公司；BEH C色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）美国Waters公司；SK-1涡旋混匀器 常州国华电器有限公司；BS323S电子天平 德国Sartorius公司；TD5AWS离心机 上海卢湘仪仪器有限公司；N-EVAP氮吹仪美国Organomation公司；Milli-Q超纯水系统 德国默克公司。

1.3 方法

1.3.1 溶液配制

标准溶液：称取一定量标准物质，用甲醇溶解，配制成一定质量浓度的标准储备液。分别量取适量的标准储备液，用甲醇稀释、定容，配制成1.0 mg/L的混合标准溶液。标准工作溶液用甲醇逐级稀释混合标准溶液获得。基质匹配标准溶液由阴性样品的提取液经氮吹近干后用标准工作液复溶后获得。

1 mmol/L碳酸铵溶液：称取0.157 g碳酸铵固体溶解于1 000 mL水中。

1.3.2 样品前处理

称取2.0 g食用油于10 mL塑料离心管中，加入4 mL甲醇-乙腈（1∶1，/）溶液，涡旋10 s，于5 000 r/min离心5 min，取2 mL上清液于10 mL塑料离心管中，70 ℃氮吹至近干，加入0.5 mL甲醇复溶后，经0.22 μm聚四氟乙烯滤膜过滤到装有塑料内衬管的进样瓶中，上机待测。

1.3.3 仪器条件

1.3.3.1 色谱条件

流动相：A为乙腈，B为1 mmol/L碳酸铵溶液；流速0.3 mL/min；进样量2.0 μL；柱温30 ℃；梯度洗脱条件：0.0～1.0 min，10% A、90% B；1.0～4.0 min，10%～95% A、90%～5% B；4.0～7.0 min，95% A、5% B；7.1 min，10% A、90% B。

1.3.3.2 质谱条件

电喷雾负离子电离模式；多反应监测扫描；加热模块温度400 ℃；脱溶剂管温度250 ℃；雾化气（氮气）流速3.0 L/min；干燥气（氮气）流速15 L/min；碰撞气（氩气）压力230 kPa。5 种链格孢霉毒素的质谱参数见表1。

表1 5 种链格孢霉毒素的质谱参数Table 1 Mass spectrometry parameters of 5 kinds of Alternaria toxins

1.4 数据处理

采用Labsolutions软件（Shimadzu公司）进行超高液相色谱-串联质谱分析，Microsoft Excel进行统计计算，ChemDraw Ultro 8.0软件进行链格孢霉毒素结构式的绘制，OriginPro 8.5软件进行链格孢霉毒素总离子流图绘制。

2 结果与分析

2.1 仪器条件优化

2.1.1 色谱条件优化

p值是影响化合物色谱行为的因素之一。AOH、ALT、AME的p值分别为7.6、7.5、7.7，呈弱酸性，TEN呈中性。这4 种毒素在C柱上都能较好地保留。TeA的p值为4.3，酸性比其他4 种毒素强，极性更大。首先测试Waters HSS T3（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）和Waters Fluoro-Phenyl（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）两款适合分析极性化合物的色谱柱，发现使用这两款分离柱未能获得TeA目标峰。在同样条件下测试了其他几种色谱柱，包括Agilent Eclipse XDB C（150 mm×2.1 mm，3.5 μm）、Agilent ZORBAX SB C（150 mm×2.1 mm，3.5 μm）、Waters BEH C（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）、Waters Phenyl-Hexyl（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）、SHIMADZU Shim-pack XR-ODS（75 mm×2.0 mm，1.6 μm）、GL Sciences Bio C（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）等，发现TeA仅在XDB C上出峰。这可能与这款色谱柱采用了封端的技术，覆盖了硅醇基，减弱了TeA与硅醇基之间的相互作用。但封端并没有完全覆盖硅醇基，导致TeA峰宽过大、拖尾，峰形不平滑尖锐，在尝试各种流动相条件后仍不能改善。

草甘膦的极性强而且具有螯合性，性质与TeA相似。前期实验室在碱性流动相条件下，获得较好的草甘膦色谱峰，受其启发，尝试在流动相中加入碳酸铵，使用耐碱性的BEH C色谱柱分离5 种毒素，获得较好的TeA色谱峰，其他4 种毒素峰形和灵敏度都得到了改善和提高。以甲醇作有机流动相时，在291/229（ALT定量离子对）通道中ALT的出峰时间前后基线较高，可能会影响ALT的定量。尝试变化流动相梯度洗脱程序，基线异常的情况没有改变。以乙腈作流动相时，基线恢复正常，因此把碳酸铵溶液和乙腈作为流动相。考察碳酸铵在1、2 mmol/L和3 mmol/L质量浓度条件下毒素响应值，发现随着碳酸铵浓度的增加，5 种毒素的灵敏度均有部分降低。因此，确定碳酸铵使用浓度为1 mmol/L。最终确定以乙腈和1 mmol/L碳酸铵溶液为流动相，以BEH C柱为分离柱进行5 种毒素的分析。

2.1.2 质谱条件的选择

5 种毒素分别用甲醇配制成质量浓度1.0 mg/L的单标准溶液，采用流动注射方式，在/100～1 000范围内进行正负全扫描。5 种毒素均能找到相应的加氢和减氢母离子。一般情况下加氢离子的灵敏度高于减氢离子，通常会选择灵敏度更高的加氢离子作母离子进行后续的条件优化。考虑到流动性为碱性，更有利于氢的失去，因此选择5 种毒素的减氢离子作为母离子。对确定的母离子进行打碎，分别找到响应高的2 个产物离子作为子离子。在确定的母离子和子离子的基础上，优化Q1、Q3电压和碰撞电压等参数，获得5 种毒素的质谱参数（表1），典型色谱图见图2。

图2 定量限质量浓度下的链格孢霉毒素总离子流图Fig. 2 Total ion current chromatogram of Alternaria toxins at LOQ

2.2 前处理条件优化

2.2.1 提取条件的优化

影响提取效率的因素有很多，其中包括溶剂对目标物的溶解性、溶剂对基质的浸透和扩散能力以及提取时间等。正交试验能从多个因素中快速找到影响结果的关键因素和最优方案。因此，本研究选取提取溶剂、提取剂体积和提取时间3 个影响提取效率的主要因素设计3因素3水平正交试验，以回收率为指标，每组实验重复3 次，正交试验结果见表2。

表2 正交试验设计及结果（n=3）Table 2 Orthogonal array design and experimental results (n = 3)

从表2可以看出，对于TeA，提取溶剂的类型对结果影响最大，提取剂体积和时间影响较小。极性较强的甲醇有利于TeA的提取，而纯乙腈提取效率最差，这可能与TeA的极性较强有关。提取溶剂类型对结果影响较大的还有AME，但对于AME，乙腈是较好的提取溶剂，这可能与AME具有亲酯性，极性较小有关。提取剂体积对AME的影响次之，从结果看4 mL的提取体积更有利于AME的提取，影响最小的是提取时间。另外3 种毒素ALT、AOH和TEN的情况一致，提取剂体积对回收率影响最大，溶剂类型影响次之，提取时间影响最小，从结果看，4 mL体积对这3 种毒素提取效果最好。从整体看，TeA和AME对溶剂类型要求较高，甲醇和乙腈混合提取兼顾了二者的极性，提取效果最好，ALT、AOH、TEN和AME在4 mL体积时提取效果最佳，TeA在3 种体积下，提取效率相差不大，因此确定5 种毒素的提取体积为4 mL，而提取时间对目标物的回收率结果影响最小，考虑效率因素，确定提取时间为10 s。

2.2.2 其他条件的确定

前处理中使用玻璃离心管会降低AOH、AME和TeA的回收率，因此涡旋提取过程应使用塑料离心管。玻璃进样瓶对TeA的吸附较明显，长时间进样，TeA的响应值会有降低，应使用塑料或带有塑料内衬管进样瓶。尼龙滤膜对AME和AOH有吸附，而聚四氟乙烯膜对这5 种毒素均没有吸附，应使用聚四氟乙烯有机系膜。

2.3 基质效应和线性范围

基质效应评价主要是比较基质匹配标准曲线和溶剂标准曲线的斜率，计算公式为：基质效应/%=（基质匹配标准曲线斜率/溶剂标准曲线斜率－1）×100。葵花籽油、大豆油阴性样品经提取、氮吹后，用标准工作溶液复溶得到5 种毒素系列基质匹配标准溶液。标准工作溶液使用甲醇配制。表3显示，AOH、ALT、TEN和AME的质量浓度范围为0.002～0.2 mg/L，TeA质量浓度范围为0.02～0.2 mg/L。5 种毒素在配制的质量浓度范围内线性良好，≥0.998。代表性的两种基质中5 种毒素的基质效应在2.9%～18.7%之间，均小于20%，说明在该前处理和仪器条件下，5 种毒素在植物油基质中存在弱的基质效应，可以忽略。在定量时可以直接使用溶剂标准曲线。

表3 典型链格孢霉毒素的线性范围和基质效应Table 3 Linear ranges and matrix effect of typical Alternaria toxins

2.4 方法学评价

以阴性的葵花籽油和大豆油为代表性基质，添加3 个水平的毒素，涡旋静置1 h后，按1.3.2节前处理和1.3.3节实验条件检测，结果如表4所示，TeA在0.02、0.1 mg/kg和0.2 mg/kg添加量下，其余4 种毒素在0.002、0.02 mg/kg和0.2 mg/kg添加量下，5 种毒素的平均回收率在98%～118%之间，相对标准偏差在2.9%～17.4%之间，满足分析要求。而TeA在低于0.02 mg/kg添加量下，另外4 种毒素在低于0.002 mg/kg添加量下，其回收率和精密度不能满足检测要求。因此，根据添加回收实验，确定TeA的定量限为0.02 mg/kg，其余4 种毒素的定量限为0.002 mg/kg。

表4 典型链格孢霉毒素在2 种代表性植物油基质中的回收率和相对标准偏差（n=5）Table 4 Recoveries and RSDs of typical Alternaria toxins in two representative vegetable oils (n = 5)

2.5 实际样品检测结果

对超市购买的芝麻油、大豆油、葵花籽油、花生油等10 个植物油样品进行链格孢霉毒素检测，在芝麻油和葵花籽油中均检出AME，质量浓度分别为0.005～0.02 mg/L和0.003～0.008 mg/L，其他4 种毒素未检出，见表5。水媒法是芝麻油和葵花籽油生产的常见方法，AME具有亲酯性，在植物油生产过程中可能更多地保留在油脂层，而其他4 种毒素的极性较AME更强，更多可能进入了水层，这可能是AME检出率高的原因。

表5 实际样品检测结果Table 5 Results of determination of Alternaria toxins in actual samples

3 结 论

建立了食用植物油中5 种链格孢霉毒素简便、高效测定方法。利用正交试验优化提取溶剂、提取剂体积和提取时间等前处理要素条件。采用碳酸铵溶液和乙腈为流动相优化色谱条件和质谱条件，所建方法基质效应不明显，可以通过溶剂标准曲线直接定量，实现了植物油中链格孢霉毒素的高效检测。通过对实际样品的检测发现AME在植物油样品中检出率较高，其他4 种毒素未检出，分析可能与植物油的生产工艺有关，这对以后优化和改进相关生产工艺有一定帮助。但方法中TeA的响应相对其他4 种毒素要低，需要进一步研究和改进。