胃癌组织中Versican与WTAP的表达及其对术后复发或转移的影响研究*

孙虎，孙颖，王静松

（1.淮安市第一人民医院分院 普外科，江苏 淮安 223002；2.淮安市第一人民医院普外科，江苏 淮安 223300）

胃癌居癌症发病率第2 位，我国是胃癌高发国家，约占全世界发病、病死人数的1/2[1-2]。目前手术仍是根治早期胃癌的主要手段，虽然可将大部分病灶切除，但预后仍不理想，其中术后复发或转移仍是造成患者死亡的主要原因[3]。癌细胞复发转移是较为复杂的生理、病理过程，涉及癌细胞从原发瘤体脱落向周围组织浸润、入侵血管、增殖分化等。目前国内外研究证实多功能蛋白聚糖Versican 参与胃癌[4]、胰腺癌[5]、子宫内膜癌[6]等多种癌症的发生、发展，与癌细胞的迁移、浸润关系密切。成肾细胞瘤1-结合蛋白（Wilms' tumor 1-associating protein,WTAP）是N6- 甲 基 腺 苷（N6-Methyladenosine,m6A）甲基转移酶复合物的组成部分，可将m6A 甲基转移酶METTI3 和METTL14 募集到相应的mRNA 靶标以共同催化m6A 的形成，m6A通路失调会影响致癌基因表达，导致肿瘤发生[7]。近期研究显示WTAP 高表达的胃癌患者预后不良风险高[8]。本研究拟验证胃癌组织中Versican 与WTAP蛋白表达与临床病理特征及术后复发或转移的关系，为胃癌治疗提供新的靶点。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2016年4月—2018年11月淮安市第一人民医院分院收治的胃癌患者101 例。其中，男性56 例，女性45 例；年龄23～75 岁，平均（50.04±9.17）岁。纳入标准：①符合《食管癌和胃癌治疗指南》[9]的胃癌诊断标准；②首次行胃癌根治术；③既往未接受任何形式的治疗；④年龄＞18 岁。排除标准：①伴有其他部位恶性肿瘤、严重内科合并症者；②重要脏器严重功能障碍及存在活动性出血、溃疡、肠穿孔、肠梗阻者；③伴有免疫缺陷性疾病、传染性疾病、血液系统疾病、全身系统性疾病者；④伴有精神性疾病、医患沟通障碍者；⑤肝、肺、腹腔等远处转移者；⑥有药物滥用史、吸毒史者；⑥血栓高度风险者；⑦伴有胃及腹部手术史者；⑧存在手术禁忌证者。剔除标准：①依从性差者；②自然失访者。本研究经医院医学伦理委员会审批准，家属签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 手术及取材依据患者肿瘤部位选择性行根治性远端胃大部切除术、根治性全胃切除术、根治性近端胃大部切除术，具体方法参照《腹腔镜胃恶性肿瘤手术操作指南（2016 版）》[10]。手术切取病灶，将距肿瘤＞2 cm 的组织作为癌旁组织，确保每位患者所切除组织包含有癌组织和癌旁组织。术后根据患者个体化情况行辅助放化疗等治疗。

1.2.2 癌组织、癌旁组织中Versican与WTAP蛋白的检测采取免疫组织化学法检测癌组织和癌旁组织中COX-2 的表达，标本石蜡包埋、切片，灭活、微波抗原修复、洗涤，添加Versican、WTAP 抗体，4℃孵育过夜，磷酸盐缓冲液冲洗，滴二氨基联苯显色液，苏木精复染、脱水、封片。染色程度为无色、淡棕色、棕色、棕褐色，分别计0 分、1 分、2 分、3 分；染色范围＜5%、5%～＜25%、25%～＜75%、≥75%，分别计0 分、1 分、2 分、3 分。计算染色程度与染色范围评分的乘积，将结果为0 分者作为阴性表达，否则作为阳性表达。

1.2.3 随访患者术后以门诊复查、住院治疗、电话等方式随访3年，每1 个月随访1 次。统计随访期间复发转移（随访中CT、胃镜等影像学证据显示肿瘤新发结节和/或肿大淋巴结出现，发现腹腔等远处转移癌灶记为复发转移[11]）情况，出现复发或转移则终止随访。

1.3 统计学方法

数据分析采用SPSS 18.0 统计软件。计量资料以均数±标准差（±s）表示，比较用t检验；计数资料以构成比或率（%）表示，比较用χ2检验；用Kaplan-Meier 法绘制生存曲线，比较用Log-rank χ2检验；影响因素的分析采用多因素Cox 回归分析。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 胃癌患者癌组织与癌旁组织中Versican、WTAP蛋白阳性表达率比较

胃癌患者癌组织、癌旁组织中Versican 与WTAP 阳性表达率比较，差异有统计学意义（P＜0.05），癌组织高于癌旁组织。见表1。

表1 胃癌患者癌组织、癌旁组织中Versican与WTAP蛋白阳性表达情况 [n=101，例（%）]

2.2 不同临床特征胃癌患者癌组织中Versican、WTAP蛋白阳性表达率比较

不同性别、年龄、病理类型、肿瘤直径的胃癌患者癌组织Versican、WTAP 阳性表达率比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。不同病理分化、浸润深度、肿瘤分期及淋巴结转移的胃癌患者癌组织Versican、WTAP 阳性表达率比较，差异有统计学意义（P＜0.05），低分化、肿瘤分期Ⅲ期、突破浆膜、淋巴结转移的胃癌患者癌组织Versican、WTAP 阳性表达率分别高于中、高分化，I或Ⅱ期，未突破浆膜，无淋巴结转移患者（P＜0.05）。见表2。

表2 不同临床特征胃癌患者癌组织中Versican、WTAP蛋白阳性表达率比较 例（%）

2.3 影响胃癌患者术后复发转移的单因素分析和多因素Cox回归分析

患者随访结束后，10 例因失访剔除（7 例为Versican 蛋白阳性表达者，3 例为Versican 蛋白阴性表达者；8 例为WTAP 蛋白阳性表达者，2 例为WTAP蛋白阴性表达者）。91 例胃癌患者中28 例（30.77%）术后出现复发转移。单因素分析结果显示，病理分级、肿瘤分期、浸润深度、淋巴结转移、Versican 阳性、WTAP 阳性是影响胃癌患者术后复发转移的影响因素（P＜0.05）。见表3。

表3 影响胃癌患者术后复发转移的单因素分析参数

以胃癌患者术后复发转移情况作为因变量（未复发转移=0，复发转移=1），病理分级、肿瘤分期、浸润深度、淋巴结转移、Versican阳性、WTAP阳性作为自变量（引入水准、剔除水准分别为0.05、0.10），进行多因素Cox 回归分析。结果显示：病理分级、肿瘤分期、淋巴结转移、Versican阳性和WTAP阳性是影响胃癌患者术后复发转移的独立因素（P＜0.05）。见表4。

表4 影响胃癌患者术后复发转移的Cox多因素分析参数

2.4 胃癌患者癌组织中Versican、WTAP表达与术后复发转移的关系

55例Versican阳性表达患者中无病生存33例，36例阴性表达患者中无病生存30 例。Versican 阳性表达患者与阴性表达患者的无病生存率比较，差异有统计学意义（χ2=5.107，P=0.024）。见图1。

图1 Versican阳性表达、阴性表达患者的Kaplan-Meier生存曲线

49 例WTAP 阳性表达患者无病生存29 例，42 例阴性表达患者中无病生存34 例。WTAP 阳性表达患者与阴性表达患者的无病生存率比较，差异有统计学意义（χ2=4.980，P=0.026）。见图2。

图2 WTAP阳性表达、阴性表达患者的Kaplan-Meier生存曲线

3 讨论

Versican 属于大聚集硫酸软骨素蛋白聚糖，是细胞外基质重要成分，与肿瘤的发生关系密切。Versican 参与肿瘤细胞的生长、迁移、侵袭、血管生成和转移等病理过程，国内外已有报道指出Versican 在胃癌[12]、肝癌[13]等多种癌症中异常高表达。但是目前关于Versican 在胃癌中的临床意义和预后价值仍缺乏数据支持。m6A 甲基化是一种众所周知的具有新表观遗传功能的修饰蛋白，目前国外已有报道指出m6A 参与胃癌的发生、发展[8]，WTAP 作为m6A 甲基化的关键组成部分在胃癌发展中的作用尚缺乏报道。基于前人研究，笔者推测Versican、WTAP 不仅参与胃癌的发生，且与胃癌根治术后复发转移有关，但目前国内尚缺乏胃癌患者癌组织中Versican、WTAP 蛋白表达与术后复发转移的关系验证的前瞻性研究报道。本研究采用免疫组织化学法检测胃癌患者癌组织、癌旁组织中Versican、WTAP 表达情况，并分析、验证胃癌癌组织中Versican、WTAP 表达与患者临床病理特征、无病生存的关系，以便为临床根治胃癌寻找新的靶点。

本研究多因素Cox 回归分析结果显示，病理分级、肿瘤分期、淋巴结转移、Versican 阳性、WTAP 阳性是影响胃癌患者术后复发转移的独立因素，提示并印证了癌组织Versican、WTAP 表达是影响胃癌患者术后复发转移的因素。细胞外基质可调节细胞迁移、分化、增殖，细胞外基质受体相互作用已被证明与胃癌等多种癌细胞增殖、侵袭有关[14]，细胞外基质富含Versican，其参与细胞外基质受体相互作用及趋化因子信号、Toll 样受体信号、T 细胞受体信号、Wnt 信号传递，细胞增殖、分化、黏附及细胞外基质的稳态及完整性变化可导致Versican 的异常表达，反过来又可调节细胞外基质组织，促进肿瘤生长，在细胞外基质中与CD44、透明质酸反应形成大分子复合物，促进肿瘤细胞运动，增加肿瘤血管生成、转移风险。m6A RNA 修饰是涉及mRNA 成熟、蛋白质翻译和分子结构转化等多个细胞过程的重要组成部分，越来越多的证据表明m6A 失调对胃癌等多种疾病的发病机制具有重要的影响。WTAP 是m6A 甲基化的关键组成部分，YU 等[15]研究发现WTAP 在体外可促进葡萄糖摄取、乳酸产生和细胞外酸化率，敲除WTAP 可抑制体内肿瘤生长。LI 等[16]研究指出，高浸润的Treg 细胞和CD4 记忆激活T 细胞可改善胃癌患者预后，WTAP 高表达可抑制免疫细胞产生，减少T 细胞浸润并抑制肿瘤免疫，WTAP 低表达患者的淋巴细胞浸润与患者良好预后相关，与本研究结论类似。

本研究显示，Versican 阴性表达者的无病生存率高于阳性表达者，WTAP 阴性表达者的无病生存率也高于阳性表达者，再次印证癌组织Versican 及WTAP 表达与胃癌患者预后有关。HUANG 等[17]报道Versican 阳性表达的胃腺癌患者的生存期明显短于Versican 阴性表达者；张捷等[18]研究显示Versican 表达是胃癌患者预后不良的独立风险因素；LI 等[19]研究显示WTAP 通过CAV-1/NF-kappaB 轴促进子宫内膜癌进展；GUAN 等[20]研究显示m6A 相关基因在胃癌中失调，WTAP 高表达增加了胃癌患者的预后不良风险；均与本研究结论类似，均提示Versican 及WTAP 蛋白表达与恶性肿瘤患者预后关系密切。

综上所述，胃癌患者癌组织中Versican 及WTAP 蛋白表达与临床病理特征及预后有关，Versican、WTAP 阳性表达患者术后复发转移风险高。但由于本研究样本量较小，未进一步统计Versican、WTAP 蛋白阳性高表达者及低表达者临床病理特征及预后，后期将针对不足之处开展多中心、大样本量试验进一步完善。